অ্যাডজুভেন্ট লিপিডয়েড-প্রতিস্থাপিত লিপিড ন্যানো পার্টিকেলগুলি SARS-CoV-2 mRNA ভ্যাকসিনগুলির ইমিউনোজেনিসিটি বাড়ায় - প্রকৃতি ন্যানো প্রযুক্তি

উপকরণ

TLR7/8 অ্যাগোনিস্ট 1 ডাইহাইড্রোক্লোরাইড কেম্যান কেমিক্যাল থেকে কেনা হয়েছিল। 1,2-Epoxydodecane (C12) সিগমা-অলড্রিচ থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল। কোর 200 এনামাইন থেকে কাস্টমাইজ করা হয়েছিল, এবং অন্যান্য পলিমাইন কোরগুলি সিগমা-অলড্রিচ এবং টিসিআই থেকে কেনা হয়েছিল। অ্যান্টি-মাউস CD16/32 অ্যান্টিবডি, APC অ্যান্টি-মাউস CD11c অ্যান্টিবডি, FITC অ্যান্টি-মাউস CD80 অ্যান্টিবডি, PE অ্যান্টি-মাউস CD86 অ্যান্টিবডি, APC অ্যান্টি-হিউম্যান CD11c অ্যান্টিবডি, FITC অ্যান্টি-হিউম্যান CD80 অ্যান্টিবডি এবং PE অ্যান্টি-হিউম্যান CD86 অ্যান্টিবডি ছিল Biolegend থেকে কেনা. মাউস IL-1β আনকোটেড ELISA, মাউস IL-12p70 আনকোটেড ELISA, মাউস TNF-α আনকোটেড ELISA, মাউস MCP-1 আনকোটেড ELISA, হিউম্যান IL-1β আনকোটেড ELISA, হিউম্যান IL-12p70 আনকোটেড ELISA, হিউম্যান TNF-α আনকোটেড ELISA, হিউম্যান TNF-α আনকোটেড ELISA ডিপ রেড, লাইসোট্র্যাকার গ্রিন, ডিও এবং ডিআইআর ইনভিট্রোজেন থেকে কেনা হয়েছিল। মাউস হ্যাপ্টোগ্লোবিন ELISA এবং মাউস IP-10 ELISA Abcam থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল। 1,2-ডিওলিওয়েল-sn-গ্লিসেরো-৩-ফসফোইথানোলামাইন, 3-ডিস্টেরয়াইল-sn-গ্লিসেরো-৩-ফসফোকোলিন, ডিএমজি-পিইজি এবং কোলেস্টেরল পাওয়া গেছে অবন্তি পোলার লিপিড থেকে। DLin-MC3-DMA এবং SM-3 MedChem Express থেকে কেনা হয়েছিল। কোডন-অপ্টিমাইজ করা m102ψ-সংশোধিত লুসিফেরেজ mRNA এবং SARS-CoV-1 ডিপ্রোলিন-মোডিফাইড স্পাইক (S2P) mRNA ভিট্রো ট্রান্সক্রিপশন দ্বারা উত্পাদিত হয়েছিল¹⁴. Cy5-ট্যাগযুক্ত luciferase mRNA ঘরে Cy5-UTP (TriLink) ইন ভিট্রো ট্রান্সক্রিপশন প্রতিক্রিয়ার অন্তর্ভুক্ত করে উত্পাদিত হয়েছিল।

সহায়ক লিপিডয়েডের সংশ্লেষণ

অ্যাডজুভেন্ট লিপিডয়েড C12-TLRa রিং-ওপেনিং প্রতিক্রিয়া ব্যবহার করে TLR12/7 অ্যাগোনিস্ট 8 ডাইহাইড্রোক্লোরাইডের সাথে epoxydodecane (C1) বিক্রিয়া করে সংশ্লেষিত হয়েছিল²⁵. সংক্ষেপে, 10 mg TLR7/8 অ্যাগোনিস্ট 1 ডাইহাইড্রোক্লোরাইড 0.8 মিলি ইথানলে একটি চৌম্বকীয় আলোড়ন বার সহ একটি কাচের শিশিতে দ্রবীভূত করা হয়েছিল। তারপর, C8 এর 20 mg যোগ করার আগে হাইড্রোক্লোরাইডকে নিরপেক্ষ করতে 12 μl ট্রাইথাইলামাইন যোগ করা হয়েছিল। শিশিটি সীলমোহর করা হয়েছিল, এবং মিশ্রণটি 48 ঘন্টার জন্য 80 C তাপমাত্রায় নাড়তে হয়েছিল। অপরিশোধিত পণ্যটি CH থেকে গ্রেডিয়েন্ট ইলুশন সহ একটি CombiFlash NextGen 300+ ক্রোমাটোগ্রাফি সিস্টেম (Teledyne ISCO) দ্বারা বিশুদ্ধ করা হয়েছিল₂Cl₂ থেকে 75:22:3 CH₂Cl₂/MeOH/NH₄ওহ (aq.)। পছন্দসই ভগ্নাংশ সংগ্রহ করা হয়েছিল (ফলন, 44%)। C12-TLRa ভর স্পেকট্রোমেট্রি দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছিল (গণনা করা MS, 728.12; পাওয়া গেছে [M + 2H]²⁺, 365.25) এবং NMR স্পেকট্রোস্কোপি। ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ (ppm): 7.78 (d, J = 8.3 Hz, 1H), 7.57 (ডবলের দ্বিগুণ, J = 8.4, 1.3 Hz, 1H), 7.35–7.29 (m, 1H), 7.27 (d, J = 7.9 Hz, 2H), 7.05–7.00 (m, 1H), 6.98 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 5.84 (s, 2H), 3.61–3.47 (m, 2H), 3.44 (s, 2H), 2.90 (t, J = 7.7 Hz, 2H), 2.68 (q, J = 1.9 Hz, 2H), 2.34 (t, J = 2.8 Hz, 2H), 1.69 (পঞ্জক, J = 7.6 Hz, 2H), 1.37 (ত্রিপলের দ্বিগুণ, J = 14.9, 7.5 Hz, 2H), 1.22 (s, 36H), 0.90–0.81 (m, 9H)।

পলিমাইন থেকে প্রাপ্ত লিপিডয়েডের সংশ্লেষণের জন্য সাধারণ পদ্ধতি

অ্যামাইনগুলিকে পরিপূর্ণ করার জন্য প্রয়োজন অনুসারে পলিমাইন কোরগুলি C12 এর অতিরিক্ত মোলের সাথে প্রতিক্রিয়া করেছিল^25,33. একটি উদাহরণ হিসাবে C12-113 নিলে, 113 কোর (1 সমতুল্য) একটি ঝরঝরে অবস্থায় 12 °C তাপমাত্রায় 4.8 ঘন্টার জন্য C48 (80 সমতুল্য) এর সাথে মিশ্রিত হয়েছিল। অশোধিত পণ্য প্রাথমিক লাইব্রেরি স্ক্রীনিং জন্য ব্যবহার করা হয়েছিল. টপ-পারফর্মিং C12-113 লিপিডয়েড শুদ্ধ করার জন্য, উপরে বর্ণিত হিসাবে অপরিশোধিত পণ্যটি আলাদা করা হয়েছিল, এবং সম্পূর্ণরূপে স্যাচুরেটেড পণ্যটি সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং ভর স্পেকট্রোমেট্রি দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছিল (গণনা করা MS, 854.49; পাওয়া গেছে [M + 2H]²⁺, 429.13) এবং পরবর্তী পরীক্ষার জন্য ব্যবহার করা হয়।

অ্যাগোনিস্ট-টিএলআর 7 মিথস্ক্রিয়াটির কাঠামোগত সিমুলেশন

TLR7/8 অ্যাগোনিস্ট 1 এবং C12-TLRa এর গঠনগুলি প্রথমে CHARMm বল ক্ষেত্রের সাথে আণবিক গতিবিদ্যা সিমুলেশন দ্বারা অপ্টিমাইজ করা হয়েছিল⁴⁵. সঠিক TLR7 প্রোটিন স্ফটিক গঠনটি TLR7/R848 কমপ্লেক্সের গঠন থেকে উদ্ভূত হয়েছিল (PDB ID, 5GMH), কোনো ligands বা দ্রাবক অণু অপসারণ²⁶. TLR7 ডাইমার এবং অ্যাগোনিস্টের মধ্যে স্ট্রাকচারাল সিমুলেশন CDocker ডকিং সিমুলেশন দ্বারা বাহিত হয়েছিল⁴⁶ এবং ইন সিটু স্ট্রাকচারাল সুপার ইমপোজিশন। সম্ভাব্য নন-কোভ্যালেন্ট মিথস্ক্রিয়া, বাঁধাই পকেট এবং TLR7 ডাইমার এবং সংশ্লিষ্ট অ্যাগোনিস্টদের মধ্যে বাঁধাই সাইটগুলির ওভারভিউ BIOVIA ডিসকভারি স্টুডিও 2018 ব্যবহার করে তৈরি করা হয়েছিল।

এলএনপি প্রণয়ন

এলএনপিগুলি মাইক্রোফ্লুইডিক মিশ্রণ দ্বারা প্রণয়ন করা হয়েছিল³⁰. সংক্ষেপে, একটি ইথানল ফেজ যেখানে লিপিডয়েড (C12-TLRa প্রতিস্থাপন সহ বা ছাড়া), ফসফোলিপিড, কোলেস্টেরল এবং DMG-PEG একটি মনোনীত মোলার অনুপাত (পরিপূরক সারণী 1) একটি জলীয় ফেজ (10 mM সাইট্রেট বাফার, pH 3) 1:3 এর প্রবাহ হার অনুপাতে mRNA এবং একটি মাইক্রোফ্লুইডিক চিপ ডিভাইসে 10:1 এর লিপিডয়েড/RNA ওজন অনুপাতে মিশ্রিত করা হয়েছিল। এলএনপিগুলিকে 1 kDa আণবিক ওজন কাট-অফ ক্যাসেটে 20×PBS এর বিপরীতে 2 ঘন্টার জন্য ডায়ালাইজ করা হয়েছিল, 0.22 μm ফিল্টারের মাধ্যমে নির্বীজিত করা হয়েছিল এবং 4 °C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়েছিল। ডিও- বা ডিআইআর-লেবেলযুক্ত এলএনপিগুলি ডায়ালাইসিসের আগে এলএনপিগুলির সাথে ডিও বা ডিআর (মোট লিপিডের 1 মল%) মিশ্রিত করে প্রাপ্ত হয়েছিল।

এলএনপি চরিত্রায়ন

এলএনপিগুলির হাইড্রোডাইনামিক আকার, পিডিআই এবং জেটা সম্ভাব্যতা একটি জেটাসাইজার ন্যানো জেডএস 90 (ম্যালভার্ন ইন্সট্রুমেন্টস) ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল। LNP-এর রূপবিদ্যা TEM (JEOL 1010) এবং K3 Bioquantum (Gatan) সহ cryo-EM (Titan Krios, Thermo Fisher) দ্বারা চিহ্নিত করা হয়েছিল। এমআরএনএ এনক্যাপসুলেশন দক্ষতা এবং পিK_a এলএনপিগুলির একটি পরিবর্তিত কোয়ান্ট-আইটি রিবোগ্রিন আরএনএ অ্যাস (ইনভিট্রোজেন) এবং একটি 6-( ব্যবহার করে নির্ধারণ করা হয়েছিলp-টোলুইডিনাইল)ন্যাপথালিন-২-সালফোনিক অ্যাসিড অ্যাস, যথাক্রমে^30,33. LNP ফর্মুলেশনগুলি নিয়মিতভাবে লিমুলাস অ্যামিবোসাইট লাইসেট (LAL) পরীক্ষা দ্বারা পরীক্ষা করা হয়েছিল এবং এন্ডোটক্সিনের মাত্রা ধারাবাহিকভাবে প্রতি মিলি প্রতি <1 এন্ডোটক্সিন ইউনিট পাওয়া গেছে।

কোষ সংস্কৃতি এবং প্রাণী অধ্যয়ন

HEK-ব্লু mTLR7 সেল লাইনটি হার্ভার্ড মেডিকেল স্কুলে জে. শি দ্বারা অনুগ্রহপূর্বক প্রদান করা হয়েছিল, যিনি এটি InvivoGen (#hkb-mtlr7) থেকে পেয়েছেন৷ এই কোষগুলি বিক্রেতার নির্দেশ অনুসারে রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল। মুরিন ম্যাক্রোফেজ DC2.4 সেল লাইন আমেরিকান টাইপ কালচার কালেকশন থেকে প্রাপ্ত হয়েছিল এবং Dulbecco-এর পরিবর্তিত ঈগলস মিডিয়ামে (DMEM) 10% ভ্রূণের বোভাইন সিরাম, 100 U ml এর সাথে পরিপূরক রক্ষণাবেক্ষণ করা হয়েছিল^-1 পেনিসিলিন এবং 100 μg ml^-1 স্ট্রেপ্টোমাইসিন। 37% CO এর আর্দ্রতাযুক্ত ইনকিউবেটরে সমস্ত কোষ 5 °C তাপমাত্রায় সংষ্কৃত করা হয়েছিল₂, এবং নিয়মিতভাবে মাইকোপ্লাজমা দূষণের জন্য পরীক্ষা করা হয়।

BMDCs C57BL/6 ইঁদুর থেকে তৈরি করা হয়েছিল। সংক্ষিপ্তভাবে, অস্থি মজ্জা কোষগুলি মাউসের ফিমার এবং টিবিয়াস থেকে ফ্লাশ করা হয়েছিল, লাল রক্তকণিকা অপসারণের জন্য অ্যামোনিয়াম-ক্লোরাইড-পটাসিয়াম (ACK) বাফার দ্বারা lysed করা হয়েছিল এবং তারপর RPMI 1640 মিডিয়ামে 10% ভ্রূণ বোভাইন সিরাম, 100 UU এর সাথে সম্পূরক করা হয়েছিল।^-1 পেনিসিলিন এবং 100 μg ml^-1 স্ট্রেপ্টোমাইসিন, 1% HEPES, 0.1 mM β-mercaptoethanol, 20 ng ml^-1 মুরিন IL-4 (#214-14, পেপ্রোটেক) এবং 20 ng ml^-1 মুরিন গ্রানুলোসাইট-ম্যাক্রোফেজ কলোনি স্টিমুলেটিং ফ্যাক্টর (#315-03, পেপ্রোটেক)। 6 তম দিনে, অ-অনুগত এবং শিথিলভাবে অনুগত কোষগুলি অধ্যয়নের জন্য সংগ্রহ করা হয়েছিল।

MoDCs একটি 38 বছর বয়সী সুস্থ পুরুষ স্বেচ্ছাসেবক দাতা থেকে তৈরি করা হয়েছিল। রোসেটসেপ হিউম্যান মনোসাইট এনরিচমেন্ট ককটেল (#15068, স্টেমসেল টেকনোলজিস) ব্যবহার করে দান করা অ্যাফেরেসিস রক্ত ​​থেকে মনোসাইটগুলিকে বিচ্ছিন্ন করা হয়েছিল এবং পেনসিলভেনিয়া বিশ্ববিদ্যালয়ের হিউম্যান ইমিউনোলজি কোর দ্বারা সরবরাহ করা হয়েছিল। এই কোষগুলিকে 20 ng ml-এর সাথে সম্পূরক সম্পূর্ণ RPMI মাধ্যমে সংস্কৃতির মাধ্যমে MoDC-তে প্ররোচিত করা হয়েছিল^-1 মানব IL-4 (#574002, বায়োলেজেন্ড) এবং 20 ng ml^-1 মানব গ্রানুলোসাইট-ম্যাক্রোফেজ কলোনি স্টিমুলেটিং ফ্যাক্টর (#572902, বায়োলেজেন্ড) 6 দিনের জন্য। এই গবেষণাটি পেনসিলভানিয়া বিশ্ববিদ্যালয়ের প্রাতিষ্ঠানিক পর্যালোচনা বোর্ড (#705906) দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল। দাতার কাছ থেকে অবহিত সম্মতি নেওয়া হয়েছিল, যাকে এই রক্তদানের জন্য ক্ষতিপূরণ দেওয়া হয়েছিল।

সমস্ত প্রাণী প্রোটোকল পেনসিলভানিয়া বিশ্ববিদ্যালয়ের ইনস্টিটিউশনাল অ্যানিমাল কেয়ার অ্যান্ড ইউজ কমিটি (#806540) দ্বারা অনুমোদিত হয়েছিল এবং পেনসিলভানিয়া বিশ্ববিদ্যালয়ের ল্যাবরেটরি অ্যানিম্যালসের যত্ন ও ব্যবহারের নির্দেশিকা অনুসারে পশু পদ্ধতিগুলি সম্পাদিত হয়েছিল। C57BL/6 মহিলা ইঁদুর (6-8 সপ্তাহ বয়স, 18-20 g শরীরের ওজন) জ্যাকসন ল্যাবরেটরি থেকে কেনা হয়েছিল।

ইন ভিট্রো mLuc ডেলিভারি

ডিসি সেল, বিএমডিসি বা এমওডিসি রাতারাতি কূপ প্রতি 96 ঘনত্বে একটি 10,000-ওয়েল প্লেটে বীজ করা হয়েছিল এবং তারপর 24 ঘন্টার জন্য নির্দেশিত ডোজগুলিতে কোষগুলির চিকিত্সার জন্য mLuc-লোডড LNPs ব্যবহার করা হয়েছিল। Luciferase এক্সপ্রেশনটি Luciferase Reporter 1000 Assay System (E4550, Promega) দ্বারা মূল্যায়ন করা হয়েছিল এবং প্রস্তুতকারকের প্রোটোকল অনুসারে সেলটাইটার-গ্লো লুমিনেসেন্ট সেল ভায়েবিলিটি অ্যাসে (G7572, Promega) ব্যবহার করে কোষের কার্যক্ষমতা পরিমাপ করা হয়েছিল। আপেক্ষিক লুসিফেরেস এক্সপ্রেশনটি আপেক্ষিক আলোর ইউনিটগুলি কোষের কার্যক্ষমতাতে স্বাভাবিক হিসাবে রিপোর্ট করা হয়েছিল। ফ্রি এমআরএনএ একটি নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল।

TLR7 রিপোর্টার অ্যাস

C7-TLRa-এর TLR12-অ্যাগোনিস্টিক কার্যকলাপ প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে একটি HEK-ব্লু ডিটেকশন কিট (#hb-det7, InvivoGen) ব্যবহার করে HEK-Blue mTLR2 রিপোর্টার কোষগুলিতে পরীক্ষা করা হয়েছিল। সংক্ষেপে, HEK-ব্লু mTLR7 রিপোর্টার কোষগুলি C96-TLRa এর বিভিন্ন ঘনত্ব ধারণকারী HEK-ব্লু ডিটেকশন মিডিয়ামে প্রতি কূপের 40,000 কোষের ঘনত্বে একটি 12-ওয়েল প্লেটে বীজ করা হয়েছিল। 24 ঘন্টার জন্য ইনকিউবেশনের পরে, 650 nm-এ শোষণ একটি প্লেট রিডার (ইনফিনিট M200, টেকান) ব্যবহার করে পরিমাপ করা হয়েছিল এবং ডেটা চিকিত্সা না করা কোষগুলিতে স্বাভাবিক করা হয়েছিল। TLR7/8 অ্যাগোনিস্ট 1 একটি ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে ব্যবহৃত হয়েছিল। একইভাবে, এলএনপিগুলির TLR7-অ্যাগোনিস্টিক কার্যকলাপ পরিমাপ করা হয়েছিল।

সেলুলার আপটেক

DC2.4 কোষকে 35 মিমি গ্লাস-বটম ডিশে 24 ঘন্টার জন্য বীজ দেওয়া হয়েছিল এবং তারপর 12 ng ml এর mRNA ঘনত্বে DiO-লেবেলযুক্ত C113-12 LNP বা DiO-লেবেলযুক্ত C113-500/TLRa LNP দিয়ে চিকিত্সা করা হয়েছিল।^-1 2 ঘন্টার জন্য কোষগুলিকে ক্রমানুসারে 100 মিনিটের জন্য লাইসোট্র্যাকার ডিপ রেড (30 nM) এবং Hoechst 33342 (10 μg ml) দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল^-1) 5 মিনিটের জন্য। একটি কনফোকাল লেজার স্ক্যানিং মাইক্রোস্কোপ (LSM 710, Zeiss) ব্যবহার করে ছবিগুলি অবিলম্বে নেওয়া হয়েছিল।

ভিট্রোতে ডিসি পরিপক্কতা এবং সাইটোকাইন উত্পাদনের বিশ্লেষণ

DC2.4 কোষ বা BMDC গুলিকে 12 × 1 এর ঘনত্বে 10-ওয়েল প্লেটে বীজ দেওয়া হয়েছিল⁶ রাতারাতি ভাল প্রতি কোষ এবং তারপর SARS-CoV-2 mRNA- লোডেড LNPs (500 ng ml) দিয়ে চিকিত্সা করা হয়^-124 ঘন্টার জন্য। কোষ সংস্কৃতিগুলি TNF-α, IL-12p70 এবং IL-1β এর ELISA এর জন্য সংগ্রহ করা হয়েছিল। কোষগুলি সংগ্রহ করা হয়েছিল, অ্যান্টি-মাউস CD16/32 অ্যান্টিবডি দিয়ে ব্লক করা হয়েছিল এবং তারপরে APC অ্যান্টি-মাউস CD11c অ্যান্টিবডি, FITC অ্যান্টি-মাউস CD80 অ্যান্টিবডি এবং PE অ্যান্টি-মাউস CD86 অ্যান্টিবডি দিয়ে 30 °C তাপমাত্রায় 4 মিনিটের জন্য ফ্লো সাইমেট বিশ্লেষণ করার আগে দাগ দেওয়া হয়েছিল। (BD, LSR II)। একইভাবে, MoDCs চিকিত্সা করা হয়েছিল। মানুষের TNF-α, IL-12p70 এবং IL-1β এর ELISA-এর জন্য কোষ সংস্কৃতি সংগ্রহ করা হয়েছিল। MoDCs সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং বিশ্লেষণের আগে APC অ্যান্টি-হিউম্যান CD11c অ্যান্টিবডি, FITC অ্যান্টি-হিউম্যান CD80 অ্যান্টিবডি এবং PE অ্যান্টি-হিউম্যান CD86 অ্যান্টিবডি দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল। অ্যান্টিবডিগুলি প্রস্তুতকারকের নির্দেশ অনুসারে 1:100 এ একটি সাধারণ তরল সহ ব্যবহার করা হয়েছিল।

ভিভোতে ডিসি পরিপক্কতা এবং সাইটোকাইন উত্পাদনের বিশ্লেষণ

প্রতিটি মাউস থেকে দুটি আইএলএন 24 ঘন্টা SARS-CoV-2 mRNA-লোডড LNPs (প্রতি মাউস প্রতি 5 μg mRNA) ইনজেকশনের পরে সংগ্রহ করা হয়েছিল এবং সম্পূর্ণ RPMI-এর 0.1 মিলিলিটার মধ্যে জীবাণুমুক্ত কীটপতঙ্গ ব্যবহার করে আলতোভাবে যান্ত্রিকভাবে ব্যাহত হয়েছিল। একটি 1.5 ml টিউব। ফলস্বরূপ সেল সাসপেনশনগুলি সংগ্রহ করা হয়েছিল, অ্যান্টি-মাউস CD16/32 অ্যান্টিবডি দিয়ে ব্লক করা হয়েছিল এবং তারপরে ফ্লো সাইটোমেট্রি দ্বারা বিশ্লেষণ করার আগে APC অ্যান্টি-মাউস CD11c অ্যান্টিবডি, FITC অ্যান্টি-মাউস-CD80 অ্যান্টিবডি এবং PE অ্যান্টি-মাউস-CD86 অ্যান্টিবডি দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল।

রক্ত সিরাম বিভাজক টিউবে (BD #365967) রেট্রো-অরবিটাল রুটের মাধ্যমে 6 এবং 24 ঘন্টা পোস্ট-ইমিউনাইজেশনে সংগ্রহ করা হয়েছিল। ঘরের তাপমাত্রায় (r.t.) 30 মিনিটের ইনকিউবেশন পিরিয়ডের পরে রক্ত ​​থেকে সিরাম আলাদা করা হয়েছিল এবং নমুনাগুলি 10,000 এ সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিলg 5 মিনিটের জন্য। ব্যবহার না হওয়া পর্যন্ত সিরাম −20 °C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়েছিল। ইন্ট্রালিম্ফ্যাটিক সাইটোকাইন উৎপাদন বিশ্লেষণ করার জন্য, iLN থেকে সৃষ্ট কোষ সাসপেনশনগুলি প্রতি কূপ প্রতি 96 μl প্রতি 10,000 কোষের ঘনত্বে একটি 100-ওয়েল প্লেটে স্থাপন করা হয়েছিল এবং 8 h জন্য সংস্কৃত করা হয়েছিল। সিরাম নমুনা সহ TNF-α, IL-12p70 এবং IL-1β এর ELISA-এর জন্য সুপারন্যাট্যান্ট সংগ্রহ করা হয়েছিল। অতিরিক্তভাবে, হ্যাপ্টোগ্লোবিন, আইপি-১০ এবং এমসিপি-১-এর ইলিসার জন্য 6, 24 এবং 48 ঘন্টা পোস্ট-ইমিউনাইজেশনের সিরাম সংগ্রহ করা হয়েছিল।

ভিভোতে এলএনপি বিতরণ এবং স্থানান্তর

ইঁদুর ছিল s.c. প্রতি মাউসে 5 μg mRNA এর ডোজে mLuc-লোডেড LNPs সহ লেজের গোড়ায় ইনজেকশন দেওয়া হয়। 6 বা 24 ঘন্টা পোস্ট-ইনজেকশনে, ইঁদুরকে ইন্ট্রাপেরিটোনলি (আইপি) ইনজেকশন দেওয়া হয়েছিল d-লুসিফেরিন পটাসিয়াম লবণ (150 mg প্রতি কেজি (শরীরের ওজন)), এবং বায়োলুমিনেসেন্স ইমেজিং একটি IVIS ইমেজিং সিস্টেমে (PerkinElmer) সঞ্চালিত হয়েছিল। সমবর্তী বায়োলুমিনেসেন্স এবং ফ্লুরোসেন্স ইমেজিং সক্ষম করতে, ডিআর-লেবেলযুক্ত, এমএলউসি-লোডেড এলএনপিগুলি ছিল এস.সি. ইঁদুর মধ্যে ইনজেকশনের. 24 ঘন্টা পোস্ট-ইনজেকশনে, ইঁদুরগুলি i.p. সঙ্গে ইনজেকশন d-লুসিফেরিন পটাসিয়াম লবণ, এবং প্রধান অঙ্গ এবং আইএলএন বায়োলুমিনিসেন্স এবং ফ্লুরোসেন্স ইমেজিংয়ের জন্য সংগ্রহ করা হয়েছিল।

ভিভো ইমিউনাইজেশনে

ইঁদুর ছিল s.c. SARS-CoV-2 mRNA-লোডড LNPs-এর সাথে প্রতি মাউসে 1 বা 5 μg mRNA ডোজ দিয়ে 3 সপ্তাহের ব্যবধানে প্রাইম-বুস্ট কৌশল ব্যবহার করে দুইবার টিকা দেওয়া। পরীক্ষার সময় সপ্তাহে দুবার শরীরের ওজন রেকর্ড করা হয়েছিল। উপরে বর্ণিত হিসাবে সিরাম বিভাজক টিউব ব্যবহার করে সিরাম সংগ্রহ করা হয়েছিল, −20 °C তাপমাত্রায় সংরক্ষণ করা হয়েছিল এবং ELISA এবং ভাইরাস নিরপেক্ষকরণের জন্য ব্যবহৃত হয়েছিল। বুস্ট ভ্যাকসিনেশনের দুই সপ্তাহ পরে, ইঁদুরকে অ্যানাস্থেটাইজ করা হয়েছিল এবং ফ্লো সাইটোমেট্রি বিশ্লেষণের জন্য প্লীহা সংগ্রহ করা হয়েছিল।

ELISA ব্যবহার করে অ্যান্টি-আরবিডি অ্যান্টিবডি টাইটার নির্ধারণ করা

বিশুদ্ধ SARS-CoV-2 তার ট্যাগ করা RBD (1 μg ml^-1) (সিনো বায়োলজিক্যাল, #40592-V08H) রাতারাতি হাই বাইন্ড স্ট্রিপওয়েল কর্নিং 96-ওয়েল ক্লিয়ার পলিস্টাইরিন মাইক্রোপ্লেট কোট করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। প্লেটগুলি একবার ওয়াশ বাফার (0.05% টুইন 20/PBS) দিয়ে ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল এবং r.t-এ 2 ঘন্টার জন্য ব্লক করা হয়েছিল। তাপ-নিষ্ক্রিয়, IgG-ক্ষয়প্রাপ্ত, প্রোটিজ-মুক্ত বোভাইন সিরাম অ্যালবুমিন (2% w/v BSA/PBS) এর সমাধান ব্যবহার করে। তারপরে, প্লেটগুলি তিনবার ধুয়ে নেওয়া হয় এবং মাউস সেরাকে ব্লকিং দ্রবণে ক্রমাগতভাবে মিশ্রিত করা হয় এবং 2 ঘন্টার জন্য r.t. এ ইনকিউব করা হয়। মোট IgG (1:10,000, Abcam #ab97040) বা সাবক্লাস (IgG1, 1:10,000, Abcam, #ab98693; IgG,2, Abcam, #ab10,000; IgG,98722) এর জন্য নির্দিষ্ট হর্সরাডিশ-পেরক্সিডেস-কনজুগেটেড অ্যান্টি-মাউস সেকেন্ডারি অ্যান্টিবডি যোগ করার আগে প্লেটগুলি তিনবার ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল। #ab1.5) ব্লকিং বাফারে। প্লেটগুলি 100 ঘন্টার জন্য ধূসরিত করা হয়েছিল এবং 3,3 মিনিটের জন্য প্রতি কূপে 5,5 µl KPL 8′,50′-টেট্রামেথাইলবেনজিডাইন সাবস্ট্রেট যোগ করার আগে তিনবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। 2 N সালফিউরিক অ্যাসিডের 450 µl যোগ করে প্রতিক্রিয়াটি বন্ধ করা হয়েছিল, এবং একটি SpectraMax 190 মাইক্রোপ্লেট রিডার ব্যবহার করে শোষণ XNUMX nm এ পরিমাপ করা হয়েছিল। RBD-নির্দিষ্ট IgG এন্ডপয়েন্ট ডিলিউশন টাইটারকে সিরামের সর্বোচ্চ তরল হিসাবে সংজ্ঞায়িত করা হয়েছিল যাতে ফ্রে পদ্ধতি ব্যবহার করে নির্ধারিত কাট-অফ অপটিক্যাল ঘনত্বের চেয়ে বেশি অপটিক্যাল ঘনত্ব দেওয়া হয়।⁴⁷.

সিউডোভাইরাস নিরপেক্ষকরণ অ্যাস

SARS-CoV-2 S সহ একটি VSV সিউডোটাইপ প্রথম তৈরি করা হয়েছিল³⁶. আমরা VSVΔG-RFP SARS-CoV-2 ব্যবহার করে একটি অ্যান্টিবডি নিরপেক্ষকরণ পরীক্ষা করেছি। TMPRSS6 স্থিরভাবে প্রকাশকারী ভেরো E2 কোষগুলিকে 100 μl DMEM-এ 2.5 × 10 এ বীজ দেওয়া হয়েছিল⁴ একটি 96-ওয়েল কোলাজেন-প্রলিপ্ত প্লেটে কূপ প্রতি কোষ। 12 ঘন্টার পরে, দ্বিগুণ ক্রমিকভাবে মিশ্রিত সিরামের নমুনাগুলিকে VSVΔG-RFP SARS-CoV-2 সিউডোটাইপ ভাইরাসের সাথে মিশ্রিত করা হয়েছিল (50-200 ফোকাস-ফর্মিং ইউনিট প্রতি ভাল) D614G, বিটা বা ডেল্টা ভেরিয়েন্টের স্পাইককে এনকোড করে এবং 1-এ ইনকিউব করা হয়েছিল। °সে. একটি মাউস অ্যান্টি-ভিএসভি ইন্ডিয়ানা জি, 37G8F5 (#Ab11-01401, পরম অ্যান্টিবডি), 2.0 ng ml ঘনত্বে যে কোনও সম্ভাব্য VSV-G বহনকারী ভাইরাসকে নিরপেক্ষ করতে এই মিশ্রণে অন্তর্ভুক্ত করা হয়েছিল।^-1. অ্যান্টিবডি-ভাইরাস মিশ্রণটি তখন ভেরো E6 TMPRSS2 কোষে মিডিয়া প্রতিস্থাপন করতে ব্যবহৃত হয়েছিল। 20 ঘন্টা পোস্ট-ইনফেকশনে, একটি S4 ফ্লুরোস্পট বিশ্লেষক (CTL) এর ভিজ্যুয়ালাইজেশনের আগে কোষগুলিকে 6% PFA দিয়ে ধুয়ে এবং স্থির করা হয়েছিল। পৃথক সংক্রামিত ফোসি গণনা করা হয়েছিল, এবং মানগুলি অ্যান্টিবডি ছাড়াই নিয়ন্ত্রণ কূপের সাথে তুলনা করা হয়েছিল। ফোকাস হ্রাস নিরপেক্ষকরণ টাইটার 50% (FRNT₅₀) সর্বশ্রেষ্ঠ সিরাম তরলীকরণ হিসাবে পরিমাপ করা হয়েছিল যেখানে মাউস সিরামের অনুপস্থিতিতে সিউডোটাইপ ভাইরাস দ্বারা সংক্রামিত নিয়ন্ত্রণ কোষের তুলনায় ফোকাস সংখ্যা কমপক্ষে 50% হ্রাস পেয়েছে। FRNT₅₀ প্রতিটি নমুনার জন্য টাইটারগুলি পৃথক দিনে সম্পাদিত দুটি প্রযুক্তিগত প্রতিলিপিতে পরিমাপ করা হয়েছিল।

টি এবং বি কোষের ফ্লো সাইটোমেট্রি বিশ্লেষণ

টি সেল

প্লীহাগুলি সংগ্রহ করা হয়েছিল, একক কোষ হিসাবে প্রক্রিয়া করা হয়েছিল, সম্পূর্ণ RPMI 70-এ 1640 µm সেল স্ট্রেনার ব্যবহার করে ফিল্টার করা হয়েছিল এবং সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিল এবং একটি পরিষ্কার একক-কোষ সাসপেনশন পাওয়ার জন্য ACK লাইসিস বাফারে লোহিত রক্তকণিকাগুলিকে লাইজ করা হয়েছিল। অ্যান্টিজেন-নির্দিষ্ট টি কোষ পরিমাপ করতে, দুই মিলিয়ন স্প্লেনোসাইট 2.5 µg ml দিয়ে উদ্দীপিত হয়েছিল^-1 SARS-CoV-2 RBD পেপটাইড পুলগুলির (#PM-WCPV-S-RBD-1, JPT) একটি FACS টিউবে 6 ঘন্টার জন্য 37 °C, 5% CO₂ 2 mg ml সহ^-1 অ্যান্টি-CD28 (Tonbo #40-0281-M001) সহ-উদ্দীপনা প্রদান করে। উদ্দীপনা 1 mg ml যোগ করার আগে 5 ঘন্টার জন্য এগিয়ে যায়^-1 ব্রেফেল্ডিন ​​এ (বায়োলজেন্ড #420601), 2 মিএম মোনেসিন (বায়োলজেন্ড #420701) এবং 5 মিগ্রা মিলি^-1 অ্যান্টি-CD107a Alexa Fluor 647 (বায়োলজেন্ড #121610) 5 ঘন্টার জন্য। DMSO একটি নেতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে পরিবেশন করেছে, এবং 50 mg ml এর সংমিশ্রণ^-1 ফোরবল 12-মাইরিস্টেট 13-অ্যাসিটেট এবং 1 mg ml^-1 আয়নোমাইসিন একটি ইতিবাচক নিয়ন্ত্রণ হিসাবে কাজ করে। মোট 6 ঘণ্টা পরে, নমুনাগুলি PBS দিয়ে ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল, 5 মিনিটের জন্য লাইভ/ডেড অ্যাকোয়া দিয়ে দাগ দেওয়া হয়েছিল, 16 মিনিটের জন্য অ্যান্টি-মাউস CD32/20 অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে ব্লক করা হয়েছিল এবং অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে 30 মিনিটের জন্য বহিরাগতভাবে দাগ দেওয়া হয়েছিল (পরিপূরক ডুমুর। 21d এবং 27d) কোষগুলিকে এফএসিএস বাফারে ধুয়ে, সাইটোফিক্স/সাইটোপার্ম কিট (বিডি বায়োসায়েন্সেস #554714) ব্যবহার করে স্থির এবং প্রবেশযোগ্য করা হয়েছিল এবং 30 মিনিটের জন্য অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে অন্তঃকোষীয়ভাবে দাগ দেওয়া হয়েছিল (পরিপূরক ডুমুর। 21d এবং 27d) ইন্ট্রাসেলুলার স্টেনিংয়ের পরে, কোষগুলিকে দুবার ধুয়ে 300 µl (1% PFA) দিয়ে স্থির করা হয়েছিল এবং চারটি লেজার লাইন এবং 18টি ফটোমাল্টিপ্লায়ার টিউব দিয়ে সজ্জিত একটি BD LSR II-তে নমুনাগুলি অর্জন করা হয়েছিল। গেটিং কৌশল, এবং অ্যান্টিবডি তালিকা এবং ক্যাটালগ নম্বর পরিপূরক ডুমুরে দেওয়া আছে। 21 এবং 27.

মেমরি বি সেল

প্লীহাগুলি সংগ্রহ করা হয়েছিল, একক কোষ হিসাবে প্রক্রিয়া করা হয়েছিল, সম্পূর্ণ RPMI 40 এ 1640 µm সেল স্ট্রেনার ব্যবহার করে ফিল্টার করা হয়েছিল এবং 300 এ সেন্ট্রিফিউজ করা হয়েছিলg 5 মিনিটের জন্য; লোহিত রক্তকণিকাগুলিকে ACK (1 মিনিট) দিয়ে লাইজ করা হয়েছিল, দুবার ধুয়ে এবং গণনা করা হয়েছিল, এবং প্রতি নমুনা প্রতি দুই মিলিয়ন কোষকে 16 °C তাপমাত্রায় 32 মিনিটের জন্য অ্যান্টি-মাউস CD20/4 অ্যান্টিবডি দিয়ে ইনকিউব করা হয়েছিল। তারপরে কোষগুলি FACS বাফার (1% BSA/PBS) দিয়ে ধুয়ে এবং অ্যান্টিবডি ব্যবহার করে 1 ঘন্টার জন্য দাগ দেওয়া হয়েছিল (পরিপূরক চিত্র। 23d) দাগ লাগানোর পরে, কোষগুলিকে দুবার ধুয়ে 300 µl (1% PFA) দিয়ে স্থির করা হয়েছিল এবং চারটি লেজার লাইন এবং 18টি ফটোমাল্টিপ্লায়ার টিউব দিয়ে সজ্জিত একটি BD LSR II-তে নমুনাগুলি অর্জন করা হয়েছিল। গেটিং কৌশল, এবং অ্যান্টিবডি তালিকা, ফ্লুরোসেন্ট RBD প্রোব¹⁴ এবং ক্যাটালগ নম্বরগুলি পরিপূরক চিত্রে দেওয়া হয়েছে। 23.

ELISpot পরীক্ষা

অস্থি মজ্জা ফেমারস এবং টিবিয়া থেকে FACS বাফারে ফ্লাশ করা হয়েছিল এবং একটি 63 µm নাইটেক্স জালের মাধ্যমে ফিল্টার করা হয়েছিল। লোহিত রক্তকণিকা বরফের উপর 5 মিনিটের জন্য ACK বাফারে lysed হয়েছিল এবং FACS বাফার দিয়ে দুবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল। ফলস্বরূপ কোষগুলি একটি বেকম্যান কাল্টার ভাইসেল ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল। মাল্টিস্ক্রিনএইচটিএস আইপি ফিল্টার প্লেট, 0.45 µm (মিলিপুর সিগমা, MSIPS4W10), 10 μg ml এ RBD প্রোটিন অ্যান্টিজেনের সাথে প্রলিপ্ত ছিল^-1 সোডিয়াম কার্বনেট/সোডিয়াম বাইকার্বোনেট বাফার pH 9.6 (35 mM NaHCO) এ₃ এবং 15 mM Na₂CO₃) 1 ঘন্টার জন্য 37 °C এ। তারপরে প্লেটগুলি প্রতি কূপে 200 µl PBS দিয়ে তিনবার ধুয়ে নেওয়া হয়েছিল এবং 37 °C তাপমাত্রায় সম্পূর্ণ RPMI-এ 30 মিনিটের জন্য ব্লক করা হয়েছিল। অস্থি মজ্জা কোষগুলি প্রতি কূপে এক মিলিয়ন মোট অস্থি মজ্জা কোষ দিয়ে শুরু করে ছয়টি অর্ধেক পাতলা করে প্রলেপ দেওয়া হয়েছিল এবং সম্পূর্ণ RPMI তে রাতারাতি ইনকিউব করা হয়েছিল। তারপরে প্লেটগুলিকে ওয়াশ বাফার (1×PBS + 0.1% Tween 20) দিয়ে পাঁচবার ধুয়ে ফেলা হয়েছিল, এবং বায়োটিনিলেটেড অ্যান্টি-আইজিজি সনাক্তকরণ অ্যান্টিবডি (ছাগল অ্যান্টি-মাউস আইজিজি হিউম্যান অ্যাডস-BIOT; সাউদার্ন বায়োটেক, 1030-08) একটি ফাইনালে যোগ করা হয়েছিল। 3 μg ml এর পাতলা^-1 2% BSA/PBS-এ এবং r.t-এ ইনকিউবেটেড। 1ঘন্টার জন্য। প্লেটগুলি আবার পাঁচবার ধোয়া হয়েছিল এবং r.t-এ ইনকিউবেশনের আগে স্ট্রেপ্টাভিডিন-ক্ষারীয় ফসফেটেস (1% BSA/PBS-এ 20,000:2 তরলীকরণ) যোগ করা হয়েছিল। 30 মিনিটের জন্য। তারপরে প্লেটগুলিকে ওয়াশ বাফার দিয়ে পাঁচবার ধোয়া হয়েছিল এবং 50 µl প্রতি ভাল 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro ব্লু টেট্রাজোলিয়াম ক্লোরাইড দ্রবণ (Sigma, #B1911, 100 ml) যোগ করা হয়েছিল ~10 মিনিট বা 100 µl 1 M সোডিয়াম ফসফেট মনোব্যাসিক দ্রবণ দিয়ে বিক্রিয়াটি নিভিয়ে ফেলার সময় দাগ তৈরি না হওয়া পর্যন্ত। প্লেটগুলি ডিওনাইজড এইচ দিয়ে ধুয়ে ফেলার পরে₂O এবং রাতারাতি শুকানো, সেগুলি স্ক্যান করা হয়েছিল এবং একটি S6 ফ্লুরোস্পট বিশ্লেষক ব্যবহার করে গণনা করা হয়েছিল।

পরিসংখ্যান এবং প্রজননযোগ্যতা

সমস্ত ডেটা গড় হিসাবে উপস্থাপিত হয়। ছাত্রের tগ্রাফপ্যাড প্রিজম 7.0 ব্যবহার করে দুটি গ্রুপের মধ্যে বা একাধিক গ্রুপের মধ্যে তুলনা করার জন্য Tukey-এর পরীক্ষা অনুসরণ করে ভ্যারিয়েন্স (ANOVA) পরীক্ষা বা একমুখী বিশ্লেষণ প্রয়োগ করা হয়েছিল। P < 0.05 পরিসংখ্যানগতভাবে তাৎপর্যপূর্ণ বলে বিবেচিত হয়েছিল। প্রতিটি পরীক্ষার অনুরূপ ফলাফল সহ স্বাধীনভাবে কমপক্ষে তিনবার পুনরাবৃত্তি হয় এবং প্রতিনিধি ডেটাসেট উপস্থাপন করা হয়।

রিপোর্ট সারাংশ

গবেষণা নকশা আরও তথ্য পাওয়া যায় প্রকৃতি পোর্টফোলিও রিপোর্টিং সারাংশ এই নিবন্ধের সাথে যুক্ত।

• এসইও চালিত বিষয়বস্তু এবং পিআর বিতরণ। আজই পরিবর্ধিত পান।
• PlatoData.Network উল্লম্ব জেনারেটিভ Ai. নিজেকে ক্ষমতায়িত করুন। এখানে প্রবেশ করুন.
• প্লেটোএআইস্ট্রিম। Web3 ইন্টেলিজেন্স। জ্ঞান প্রসারিত. এখানে প্রবেশ করুন.
• প্লেটোইএসজি। মোটরগাড়ি / ইভি, কার্বন, ক্লিনটেক, শক্তি, পরিবেশ সৌর, বর্জ্য ব্যবস্থাপনা. এখানে প্রবেশ করুন.
• ব্লকঅফসেট। পরিবেশগত অফসেট মালিকানার আধুনিকীকরণ। এখানে প্রবেশ করুন.
• উত্স: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01404-4