Ένα νέο εργαλείο επεξεργασίας γονιδίων ανταγωνίζεται το CRISPR και μπορεί να κάνει εκατομμύρια επεξεργασίες ταυτόχρονα

Με τη μετεωρική άνοδο του CRISPR ως θαύμα επεξεργασίας γονιδίων, είναι εύκολο να ξεχάσουμε την ταπεινή προέλευσή του: ανακαλύφθηκε για πρώτη φορά ως μια ιδιορρυθμία του βακτηριακού ανοσοποιητικού συστήματος.

Φαίνεται ότι τα βακτήρια έχουν περισσότερα να προσφέρουν. Αυτό το μήνα, μια ομάδα με επικεφαλής τον διάσημο συνθετικό βιολόγο Dr. Τζορτζ Εκκλησία στο Πανεπιστήμιο του Χάρβαρντ άρπαξαν ένα άλλο παράξενο κομμάτι της βιολογίας των βακτηρίων. Το αποτέλεσμα είναι ένα ισχυρό εργαλείο που μπορεί —θεωρητικά— να επεξεργαστεί ταυτόχρονα εκατομμύρια αλληλουχίες DNA, με έναν «γραμμικό κώδικα» για να παρακολουθεί τις αλλαγές. Όλα αυτά χωρίς να σπάσει ούτε ένα λεπτό σκέλος DNA.

Προς το παρόν, αυτά τα βιολογικά εργαλεία, που ονομάζονται "Retron Library Recombineering (RLR)," έχουν δοκιμαστεί μόνο σε βακτηριακά κύτταρα. Αλλά όπως CRISPRτο ταξίδι στο γονιδιακή θεραπεία δείχνει, ακόμη και οι πιο περίεργες ανακαλύψεις από ταπεινά πλάσματα μπορεί να εκτοξεύσουν τα πιο τρελά μας όνειρα γονιδιακής θεραπείας ή συνθετικής βιολογίας σε πραγματικότητα.

"Αυτή η εργασία βοηθά στη δημιουργία ενός οδικού χάρτη προς τη χρήση του RLR σε άλλα γενετικά συστήματα, που ανοίγει πολλές συναρπαστικές δυνατότητες για μελλοντική γενετική έρευνα." είπε Εκκλησία.

Περιμένετε, γιατί το CRISPR είναι ανεπαρκές;

Τα ρετρόν είναι περίεργα. Ας ξεκινήσουμε με το CRISPR.

Ίσως να είστε ήδη εξοικειωμένοι με το πώς λειτουργεί. Υπάρχουν δύο συστατικά: ένας τύπος RNA και μια πρωτεΐνη. Το RNA-οδηγός «bloodhound» συνδέει την πρωτεΐνη Cas «scissor» σε ένα συγκεκριμένο γονίδιο. Στην κλασική έκδοση, ο Cas κόβει το γονίδιο για να το απενεργοποιήσει. Οι πιο πρόσφατες εξελίξεις επιτρέπουν στο Cas να αντικαταστήσει ένα συγκεκριμένο γενετικό γράμμα ή να αποκόψει πολλά γονίδια ταυτόχρονα.

Για την έκδοση chop-and-place, καθώς το γονίδιο αυτοθεραπεύεται, συχνά αναζητά ένα πρότυπο. Το CRISPR μπορεί να φέρει ένα πρότυπο γονίδιο στο οποίο μπορεί να βασιστεί το κύτταρο. Με αυτόν τον τρόπο το κύτταρο ξεγελιέται σε μια γενετική επεξεργασία αντιγράφων: αντικαθιστώντας μια ελαττωματική γενετική πρόταση με μια που είναι βιολογικά γραμματική.

Το πρόβλημα με το CRISPR είναι ο τεμαχισμός του DNA. Εάν έχετε κόψει ποτέ μια πρόταση στο τηλέφωνό σας, συνειδητοποιήσετε ότι κόψατε τα λάθος κομμάτια, την επικολλήσατε με ένα άλλο μήνυμα που τώρα δεν έχει νόημα και πατήσετε αποστολή—καλά, αυτό είναι κάπως ανάλογο με αυτό που μπορεί να συμβεί με το CRISPR. Ο κίνδυνος βλάβης στο γονιδίωμά μας αυξάνεται όταν χρειάζεται να επεξεργαστούμε πολλά γονίδια. Αυτό γίνεται ένα τεράστιο πρόβλημα στη συνθετική βιολογία, η οποία χρησιμοποιεί γενετική χειραγώγηση για να δώσει στα κύτταρα νέες ικανότητες ή ακόμα και να δημιουργήσει εντελώς νέους οργανισμούς.

Τα κύτταρα είναι επίμονα πλάσματα που αναπτύχθηκαν από αιώνες εξέλιξης, επομένως η αλλαγή ενός μόνο γονιδίου είναι σπάνια αρκετή για να κάνει, για παράδειγμα, ένα βακτήριο να αντλήσει βιοκαύσιμα ή φάρμακα, καθιστώντας απαραίτητη την πολυπλεκτική επεξεργασία γονιδίων. Τα περισσότερα κύτταρα διαιρούνται επίσης γρήγορα, έτσι ώστε είναι απαραίτητο για οποιαδήποτε γενετική σύγχυση να κολλήσει μεταξύ των γενεών. Το CRISPR συχνά παλεύει και με τα δύο. Η ομάδα της Εκκλησίας πιστεύει ότι έχει μια λύση.

Γνωρίστε τους Retrons

Το νέο εργαλείο ονομάζεται RLR και το πρώτο "R" σημαίνει retrons. Αυτά είναι ευρέως διαδεδομένα αλλά εντελώς μυστηριώδη πλάσματα των οποίων η «φυσική βιολογία…είναι σε μεγάλο βαθμό άγνωστη», έγραψε η ομάδα, αν και παρόμοια με το CRISPR, μπορεί να εμπλέκονται στο ανοσοποιητικό σύστημα των βακτηρίων.

Ανακαλύφθηκαν για πρώτη φορά το 1984, τα ρετρόν είναι αιωρούμενες κορδέλες DNA σε ορισμένα βακτηριακά κύτταρα που μπορούν να μετατραπούν σε έναν συγκεκριμένο τύπο DNA - μια ενιαία αλυσίδα DNA που ονομάζεται ssDNA (ναι, είναι περίεργο). Αλλά αυτά είναι φανταστικά νέα για την επεξεργασία γονιδίων, επειδή το DNA των κυττάρων μας γίνεται εντυπωσιακές απλές αλυσίδες όταν διαιρούνται. Τέλειος συγχρονισμός για ρετρό διακόπτη και δόλωμα.

Κανονικά, το DNA μας υπάρχει σε διπλές έλικες που είναι σφιχτά τυλιγμένες σε 23 δέσμες, που ονομάζονται χρωμοσώματα. Κάθε δέσμη χρωμοσωμάτων έρχεται σε δύο αντίγραφα και όταν ένα κύτταρο διαιρείται, τα αντίγραφα διαχωρίζονται για να αντιγραφούν. Κατά τη διάρκεια αυτής της περιόδου, τα δύο αντίγραφα ανταλλάσσουν μερικές φορές γονίδια σε μια διαδικασία που ονομάζεται ανασυνδυασμός. Αυτό είναι όταν τα ρετρόν μπορούν να εισέλθουν κρυφά, εισάγοντας τους απογόνους τους ssDNA στα διαιρούμενα κύτταρα. Εάν φέρουν νέα κόλπα - ας πούμε, επιτρέποντας σε ένα βακτηριακό κύτταρο να γίνει ανθεκτικό στα φάρμακα - και εισαχθούν με επιτυχία, τότε οι απόγονοι του κυττάρου θα κληρονομήσουν αυτό το χαρακτηριστικό.

Λόγω του φυσικού μηχανισμού του κυττάρου, τα ρετρόν μπορούν να διεισδύσουν σε ένα γονιδίωμα χωρίς να το κόψουν. Και μπορούν να το κάνουν σε εκατομμύρια διαιρούμενα κύτταρα ταυτόχρονα.

«Σκεφτήκαμε ότι τα ρετρόν θα πρέπει να μας δίνουν τη δυνατότητα να παράγουμε ssDNA μέσα στα κύτταρα που θέλουμε να επεξεργαστούμε αντί να προσπαθούμε να τα εξαναγκάσουμε στο κύτταρο από το εξωτερικό και χωρίς να καταστρέψουμε το εγγενές DNA, που ήταν και οι δύο πολύ συναρπαστικές ιδιότητες», είπε η μελέτη. συγγραφέας Δρ Daniel Goodman.

Η δημιουργία του RTR

Παρόμοια με το CRISPR, το RTR έχει πολλαπλά συστατικά: το απόσπασμα γονιδίου που περιέχει μια μετάλλαξη (το δόλωμα) και δύο πρωτεΐνες, RT και SSAP (αντίστροφη μεταγραφάση και μονόκλωνες πρωτεΐνες ανόπτησης) που μετατρέπουν το ρετρόν σε ssDNA και το αφήνουν να εισαχθεί. σε ένα διαχωριστικό κελί.

Ακόμα μαζί μου?

Όπως το Game of Thrones, υπάρχουν πολλοί παίκτες. Για να το κάνουμε πιο σαφές: τα ρετρόν φέρουν τον γενετικό κώδικα που θέλουμε να εισαγάγουμε. Το RT το μετατρέπει σε μια πιο συμβατή μορφή που ονομάζεται ssDNA. και το SSAP το κολλάει στο DNA καθώς διαιρείται. Βασικά, ένας δούρειος ίππος εισβάλλει στο κύτταρο και ξεχύνει κατασκόπους που μπαίνουν στο κύτταρο - αλλάζοντας το DNA του - με τη βοήθεια ενζυματικών μάγων.

Οι δύο πρωτεΐνες είναι νέες στο πάρτι. Προηγουμένως, οι επιστήμονες προσπάθησαν να χρησιμοποιήσουν ρετρόν για επεξεργασία γονιδίων, αλλά η αποτελεσματικότητα ήταν εξαιρετικά χαμηλή - περίπου το 0.1 τοις εκατό όλων των μολυσμένων βακτηριακών κυττάρων. Οι δύο νεοεισερχόμενοι ησύχασαν το φυσικό «σύστημα συναγερμού» των βακτηρίων που διορθώνει τις αλλαγές του DNA—οπότε αγνοούν τα νέα bits DNA—και επιτρέπουν στις επεξεργασίες να εισέλθουν και να περάσουν στην επόμενη γενιά. Ένα άλλο κόλπο ήταν να στειρωθούν δύο γονίδια που κωδικοποιούν πρωτεΐνες που κανονικά καταστρέφουν το ssDNA.

Σε μια δοκιμή, η ομάδα διαπίστωσε ότι πάνω από το 90 τοις εκατό των βακτηριακών κυττάρων παραδέχθηκαν εύκολα τη νέα αλληλουχία ρετρόν στο DNA τους. Στη συνέχεια πήγαν μεγάλα. Σε σύγκριση με το CRISPR, τα ρετρόν έχουν ένα πόδι επάνω στο ότι η ακολουθία τους μπορεί να λειτουργήσει ως γραμμωτός κώδικας. Αυτό σημαίνει ότι είναι δυνατό να εκτελεστούν πολλαπλά πειράματα γονιδιακής επεξεργασίας ταυτόχρονα και να καταλάβουμε ποια κύτταρα επεξεργάστηκαν με ποιο ρετρόν ακολουθώντας την αλληλουχία του γραμμικού κώδικα.

Σε μια δοκιμή απόδειξης της ιδέας, η ομάδα εκτόξευσε ορισμένα κύτταρα βακτηρίων με ρετρόν που περιείχαν αλληλουχίες για αντοχή στα αντιβιοτικά. Αναλύοντας την αλληλουχία των γραμμάτων DNA του ρετρόν μόνο από μια δεξαμενή βακτηρίων που είχαν υποβληθεί σε θεραπεία με αντιβιοτικά, διαπίστωσαν ότι τα κύτταρα με ρετρόν -που τους έδινε τη νέα υπερδύναμη ενάντια στα φάρμακα- παρέμειναν σε πολύ υψηλότερα τμήματα από άλλα κύτταρα.

Σε μια άλλη δοκιμή, η ομάδα προσπάθησε να προσδιορίσει πόσα ρετρό θα μπορούσαν να χρησιμοποιήσουν ταυτόχρονα. Πήραν ένα άλλο στέλεχος βακτηρίων που είναι ανθεκτικό στα αντιβακτηριακά και έκοψαν το γονιδίωμά του για να δημιουργήσουν μια βιβλιοθήκη δεκάδων εκατομμυρίων ρετρόν. Στη συνέχεια κόλλησαν αυτά τα κομμάτια σε χούλα χουπ DNA - που ονομάζονται πλασμίδια - και τα επέπλεαν σε βακτηριακά κύτταρα. Όπως και πριν, η ομάδα μπορούσε εύκολα να βρει τους ρετρόν που προσέδιδαν αντιβακτηριδιακή ισχύ μέσω της αλληλουχίας των γραμμικών κωδικών αυτών που παρέμειναν ζωντανοί.

Μα γιατί?

Έτσι είναι. Αλλά ποιος είναι ο λόγος;

Ο στόχος είναι εύκολος: να βρεθεί μια άλλη λύση στο CRISPR που μπορεί να επηρεάσει εκατομμύρια κύτταρα ταυτόχρονα, χωρίς να βλάψει τα κύτταρα. Με άλλα λόγια, μεταφέρετε την επεξεργασία γονιδίων στην εποχή των μεγάλων δεδομένων, μέσω πολλαπλών γενεών.

Σε σύγκριση με το CRISPR, το νέο εργαλείο RLR είναι απλούστερο επειδή δεν απαιτεί ένα εργαλείο «οδηγού» εκτός από ένα εργαλείο «επεξεργασίας»—το retron είναι βασικά ένα δύο σε ένα. Το να μπορείς να επηρεάζεις πολλά γονίδια ταυτόχρονα —χωρίς να τα κόβεις φυσικά— το καθιστά επίσης ένα ενδιαφέρον εργαλείο για τη συνθετική βιολογία. Το εργαλείο έχει επίσης δύναμη διατήρησης. Αντί για ένα ήθος CRISPR «ένα και τελειωμένο», διαρκεί γενιές καθώς τα κύτταρα διαιρούνται.

Τούτου λεχθέντος, το RTR έχει ανταγωνισμό. Επειδή λειτουργεί καλύτερα με τα διαιρούμενα κύτταρα, μπορεί να μην είναι τόσο ισχυρό σε απρόθυμα κύτταρα που αρνούνται να χωριστούν - για παράδειγμα, στους νευρώνες. Για ένα άλλο, οι πρόσφατες αναβαθμίσεις στο CRISPR κατέστησαν δυνατή την ενεργοποίηση ή απενεργοποίηση των γονιδίων -χωρίς να τα κόψετε- μέσω της επιγενετικής.

Αλλά το RLR προσφέρει κλίμακα. «Η δυνατότητα ανάλυσης συγκεντρωμένων μεταλλαγμένων βιβλιοθηκών με γραμμωτό κώδικα με το RLR επιτρέπει τη διεξαγωγή εκατομμυρίων πειραμάτων ταυτόχρονα, επιτρέποντάς μας να παρατηρήσουμε τα αποτελέσματα των μεταλλάξεων σε όλο το γονιδίωμα, καθώς και πώς αυτές οι μεταλλάξεις μπορεί να αλληλεπιδράσουν μεταξύ τους», δήλωσε ο Church.

Image Credit: Πιτ Λινφορθ από Pixabay

Πηγή: https://singularityhub.com/2021/05/11/a-new-gene-editing-tool-rivals-crispr-and-can-make-millions-of-edits-at-once/