Herramientas de nanotecnología de ADN: del diseño a las aplicaciones: oportunidades y colaboraciones actuales - Instituto Wyss

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Conjunto de dispositivos de nanotecnología de ADN diseñados para superar cuellos de botella específicos en el desarrollo de nuevas terapias, diagnósticos y comprensión de estructuras moleculares

Inventores principales

Guillermo Shih wesley wong

Ventajas

El ADN como bloques de construcción
Aplicaciones amplias
Bajo costo con gran potencial

Herramientas de nanotecnología de ADN: del diseño a las aplicaciones

Las nanoestructuras de ADN con su potencial para la permeabilidad celular y tisular, la biocompatibilidad y la alta programabilidad a nivel de nanoescala son candidatas prometedoras como nuevos tipos de vehículos de administración de fármacos, dispositivos de diagnóstico altamente específicos y herramientas para descifrar cómo las biomoléculas cambian dinámicamente sus formas e interactúan con entre sí y con los fármacos candidatos. Los investigadores del Instituto Wyss están proporcionando un conjunto de herramientas nanotecnológicas de ADN diversas y multifuncionales con capacidades y potencial únicos para una amplia gama de áreas de investigación clínica y biomédica.

Dispositivos nanotecnológicos de ADN para la administración de fármacos terapéuticos

Las nanoestructuras de ADN tienen el potencial futuro de ser ampliamente utilizadas para transportar y presentar una variedad de moléculas biológicamente activas, como fármacos y antígenos y adyuvantes que mejoran el sistema inmunitario, para dirigirse a células y tejidos del cuerpo humano.

Origami de ADN como componentes de entrega de alta precisión de vacunas contra el cáncer

El Instituto Wyss ha desarrollado vacunas contra el cancer para mejorar las inmunoterapias. Estos enfoques utilizan andamios basados en biomateriales implantables o inyectables que presentan antígenos específicos de tumores y biomoléculas que atraen células inmunitarias dendríticas (DC) al andamio y las activan para que, después de su liberación, puedan orquestar respuestas de células T antitumorales contra los tumores. llevando los mismos antígenos. Para activarse de manera más eficaz, es probable que las CD necesiten experimentar antígenos tumorales y moléculas adyuvantes CpG que estimulan el sistema inmunitario en proporciones particulares (estequiometrías) y configuraciones que se registran con la densidad y distribución de las moléculas receptoras en su superficie celular.

Específicamente desarrollado Origami de ADN, programado para ensamblarse en bloques rígidos de celosía cuadrada que copresentan antígenos tumorales y adyuvantes a las DC dentro de andamios de biomateriales con precisión a nanoescala tienen el potencial de aumentar la eficacia de las vacunas terapéuticas contra el cáncer, y pueden funcionalizarse aún más con medicamentos contra el cáncer.

Estrategia de modificación química para proteger las nanoestructuras de ADN que liberan fármacos

Las nanoestructuras de ADN, como el origami de ADN autoensamblado, son vehículos prometedores para el suministro de fármacos y diagnósticos. Se pueden funcionalizar de manera flexible con fármacos de proteínas y moléculas pequeñas, así como características que facilitan su administración a células y tejidos diana específicos. Sin embargo, su potencial se ve obstaculizado por su limitada estabilidad en los tejidos y la sangre del cuerpo. Para ayudar a cumplir la extraordinaria promesa de las nanoestructuras de ADN, los investigadores de Wyss desarrollaron un enfoque de reticulación química fácil, efectivo y escalable que puedan proporcionar a las nanoestructuras de ADN la estabilidad que necesitan como vehículos eficaces para fármacos y diagnósticos.

En dos sencillos pasos rentables, el enfoque de Wyss primero utiliza un agente neutralizante discreto de molécula pequeña, PEG-oligolisina, que lleva múltiples cargas positivas, para cubrir estructuras de origami de ADN. A diferencia del Mg de uso común²⁺iones que neutralizan cada uno solo dos cambios negativos en las estructuras del ADN, la PEG-oligolisina cubre múltiples cargas negativas a la vez, formando así una "red electrostática" estable, que aumenta la estabilidad de las nanoestructuras de ADN unas 400 veces. Luego, aplicando un entrecruzamiento químico reactivo conocido como glutaraldehído, se introducen enlaces estabilizadores adicionales en la red electrostática, lo que aumenta la estabilidad de las nanoestructuras de ADN en otras 250 veces, extendiendo su vida media en un rango que es compatible con una amplia gama de aplicaciones clínicas.

Dispositivos nanotecnológicos de ADN como herramientas diagnósticas y analíticas ultrasensibles

La generación de nanoestructuras de ADN detectables en respuesta a una enfermedad o ácidos nucleicos específicos de patógenos, en principio, ofrece un medio para la detección de biomarcadores altamente efectivos en diversas muestras. Un evento de unión de una sola molécula de un oligonucleótido sintético a un ácido nucleico objetivo puede nuclear la creación de estructuras mucho más grandes mediante el ensamblaje cooperativo de unidades de ADN sintético más pequeñas, como mosaicos o ladrillos de ADN, en estructuras más grandes que luego se pueden visualizar en ensayos de laboratorio simples. Sin embargo, un obstáculo central para estos enfoques es la ocurrencia de (1) unión no específica y (2) eventos de nucleación no específicos en ausencia de un ácido nucleico diana específico que puede conducir a resultados falsos positivos. Los nanotecnólogos de ADN de Wyss han desarrollado dos soluciones aplicables por separado pero combinables para estos problemas.

Recuento digital de moléculas biomarcadoras con catenanos de nanointerruptor de ADN

Para permitir la detección inicial (unión) de biomarcadores con sensibilidad y especificidad ultraaltas, los investigadores de Wyss han desarrollado un tipo de nanointerruptor de ADN que, diseñado como una catenana más grande (en latín cadenacadena de significado), se ensambla a partir de subestructuras en forma de anillo entrelazadas mecánicamente con funcionalidades específicas que juntas permiten la detección y el conteo de moléculas biomarcadoras individuales. En la estructura "DNA Nanoswitch Catenane", ambos extremos de una hebra de ADN sintético más larga están unidos a dos fragmentos de anticuerpos que se unen específicamente a diferentes partes de la misma molécula de biomarcador de interés, lo que permite una alta especificidad y sensibilidad del objetivo.

Este evento de puente hace que la hebra se cierre en un "anillo anfitrión", que está entrelazado en diferentes regiones con diferentes "anillos invitados". El cierre del anillo anfitrión cambia los anillos invitados a una configuración que permite la síntesis de una nueva hebra de ADN. La hebra de diagnóstico recién sintetizada se puede detectar sin ambigüedades como un recuento de una sola molécula digital, mientras que la interrupción del complejo fragmento de anticuerpo/biomarcador inicia un nuevo ciclo de recuento de biomarcadores. Tanto la especificidad de unión a la diana como la síntesis de una hebra de ADN específica de la diana también permiten la combinación de múltiples catenanos de nanointerruptores de ADN para contar simultáneamente diferentes moléculas de biomarcadores en una única reacción multiplexada.

Para diagnósticos ultrasensibles, es deseable tener la amplificación más rápida y la tasa más baja de nucleación espuria. Los enfoques de nanotecnología de ADN tienen el potencial de ofrecer esto de una manera libre de enzimas y de bajo costo.

william shih

Una plataforma de amplificación rápida para diversos biomarcadores

A plataforma de detección y amplificación rápida, de bajo costo y sin enzimas evita la nucleación y la amplificación no específicas y permite el autoensamblaje de estructuras a escala micrométrica mucho más grandes a partir de una sola semilla en solo minutos. El método, llamado “Detección de nanosemillas entrecruzadas” permite el ensamblaje ultracooperativo de cintas a partir de un solo evento de unión de biomarcadores. Las estructuras a escala micrométrica están densamente tejidas a partir de "láminas de ADN" de una sola hebra, por lo que una lámina de entrada serpentea por encima y por debajo de seis o más láminas previamente capturadas en un extremo de cinta en crecimiento de manera "entrecruzada", formando interacciones débiles pero altamente específicas. con sus listones de ADN que interactúan. La nucleación del proceso de ensamblaje es estrictamente específica de la semilla objetivo y el ensamblaje se puede llevar a cabo en una reacción de un solo paso en aproximadamente 15 minutos sin la adición de más reactivos y en un amplio rango de temperaturas. Usando equipo de laboratorio estándar, las estructuras ensambladas pueden visualizarse rápidamente o detectarse de otro modo, por ejemplo, usando ensayos de lector de placas de fluorescencia de alto rendimiento.

OPORTUNIDAD ACTUAL – INICIO

Detección de nanosemillas entrecruzadas: Diagnóstico de enfermedades infecciosas impulsado por nanotecnología

Nanotecnología de ADN sin enzimas para la detección rápida, ultrasensible y de bajo costo de biomarcadores de enfermedades infecciosas con amplia accesibilidad en entornos de punto de atención.

El proceso de ensamblaje de ADN en el método de detección de nanosemillas entrecruzadas también se puede vincular a la acción de los catenanos de nanointerruptor de ADN que detectan de manera muy específica una molécula biomarcadora que conduce a la preservación de un registro molecular. Cada registro superviviente puede nuclear el ensamblaje de una nanoestructura entrecruzada, combinando una unión de alta especificidad con la amplificación para la detección de biomarcadores.

Los investigadores de Wyss están desarrollando actualmente el enfoque como un diagnóstico multiplexable de bajo costo para el virus SARS-CoV-19 que causa COVID-2 y otros patógenos que podrían brindar resultados precisos más rápido y a costos más bajos que las técnicas utilizadas actualmente.

Dispositivos a nanoescala para determinar la estructura y la identidad de proteínas a nivel de molécula única

La capacidad de identificar y cuantificar proteínas a partir de trazas de muestras biológicas tendría un profundo impacto tanto en la investigación básica como en la práctica clínica, desde el seguimiento de los cambios en la expresión de proteínas dentro de las células individuales hasta permitir el descubrimiento de nuevos biomarcadores de enfermedades. Además, la capacidad de determinar también sus estructuras e interacciones abriría nuevas vías para el descubrimiento y la caracterización de fármacos. En las últimas décadas, los avances en el análisis y la secuenciación del ADN sin duda han revolucionado la medicina; sin embargo, los desarrollos equivalentes para el análisis de proteínas siguen siendo un desafío. Si bien los métodos como la espectrometría de masas para la identificación de proteínas y la crioEM para la determinación de la estructura han avanzado rápidamente, aún quedan desafíos con respecto a la resolución y la capacidad de trabajar con trazas de muestras heterogéneas.

Para ayudar a enfrentar este desafío, los investigadores del Instituto Wyss han desarrollado un nuevo enfoque que combina la nanotecnología del ADN con la manipulación de una sola molécula para permitir la identificación estructural y el análisis de proteínas y otras macromoléculas. Los "calibradores de nanointerruptor de ADN" (DNC) ofrecen un enfoque de alta resolución para las "proteínas de huellas dactilares" midiendo distancias y determinando geometrías dentro de proteínas individuales en solución. Los DNC son nanodispositivos diseñados para medir distancias entre los mangos de ADN que se han unido a las moléculas objetivo de interés. Los estados DNC se pueden activar y leer usando espectroscopia de fuerza de una sola molécula, lo que permite realizar múltiples mediciones de distancia absoluta en cada molécula individual.

Los DNC podrían adaptarse ampliamente para avanzar en la investigación en diferentes áreas, incluida la biología estructural, la proteómica, el diagnóstico y el descubrimiento de fármacos.

Todas las tecnologías están en desarrollo y disponibles para colaboraciones de la industria.

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