Uus geenide redigeerimise tööriist konkureerib CRISPR-iga ja võib teha miljoneid muudatusi korraga

CRISPRi meteoriitilisse tõusuga geenide redigeerimise imena on lihtne unustada selle madalat päritolu: see avastati esmakordselt kui bakteriaalse immuunsüsteemi veidrus.

Näib, et bakteritel on rohkem pakkuda. Sel kuul juhtis meeskond kuulsa sünteetilise bioloogi Dr. George'i kirik kaaperdas Harvardi ülikoolis veel ühe kummalise bakteribioloogia tüki. Tulemus on võimas tööriist, mis saab teoreetiliselt samaaegselt redigeerida miljoneid DNA järjestusi, kasutades muudatusi jälgivat vöötkoodi. Kõik ilma ühtki õrna DNA ahelat purustamata.

Praeguseks on neid bioloogilisi tööriistu, mida nimetatakse "Retron Library Recombineeringiks (RLR)," testitud ainult bakterirakkudes. Aga CRISPRtema teekond geeniteraapia näitab, et isegi kõige veidramad avastused madalatelt olenditelt võivad meie metsikumad geeniteraapia või sünteetilise bioloogia unistused reaalsuseks katapuleerida.

"See töö aitab luua teekaardi RLR-i kasutamiseks teistes geneetilistes süsteemides, mis avab palju põnevaid võimalusi tulevasteks geeniuuringuteks." ütles Kirik.

Oota, miks on CRISPR ebapiisav?

Retronid on imelikud. Alustame hoopis CRISPR-iga.

Võib-olla olete selle toimimisega juba tuttav. Seal on kaks komponenti: teatud tüüpi RNA ja valk. "Verekoera" juht-RNA seob Cas "kääride" valgu konkreetse geeni külge. Klassikalises versioonis tükeldab Cas geeni, et see välja lülitada. Hiljutised edusammud võimaldavad Casil asendada konkreetse geneetilise tähe või lõigata mitu geeni korraga.

Tükelda ja asenda versiooni puhul otsib geen end ise paranedes sageli malli. CRISPR võib kanda malligeeni, millele rakk saab toetuda. Sel viisil meelitatakse rakk geneetilise koopia redigeerimisele: defektse geneetilise lause asendamine bioloogiliselt grammatilise lausega.

CRISPR-i probleem on DNA tükeldamine. Kui olete kunagi oma telefonis lauset katkestanud, mõistnud, et lõigasite valed osad, kleepisite selle tagasi teise sõnumiga, millel pole praegu mõtet, ja vajutasite saatmisklahvi – see on omamoodi analoogne sellega, mis võib juhtuda CRISPR-iga. Genoomi kahjustamise oht suureneb, kui peame redigeerima mitut geeni. Sellest saab tohutu probleem sünteetilises bioloogias, mis kasutab geneetilist manipuleerimist, et anda rakkudele uusi võimeid või isegi luua täiesti uusi organisme.

Rakud on kangekaelsed olendid, mis on välja arendatud evolutsiooni eoonide jooksul, mistõttu piisab harva ühe geeni muutmisest, et näiteks bakter saaks biokütuseid või ravimeid välja pumbata, mistõttu on vaja geenide multipleksimist. Enamik rakke jaguneb ka kiiresti, mistõttu on oluline, et igasugune geneetiline näpunäide püsiks põlvkondade kaupa. CRISPR on sageli hädas mõlemaga. Kiriku meeskond arvab, et neil on lahendus.

Saage tuttavaks Retronitega

Uue tööriista nimi on RLR ja esimene "R" tähistab retroneid. Need on laialt levinud, kuid täiesti salapärased olendid, kelle "looduslik bioloogia... on suures osas teadmata", kirjutas töörühm, kuigi sarnased CRISPR-iga, võivad nad olla seotud bakterite immuunsüsteemiga.

Esmakordselt 1984. aastal avastatud retronid on mõnedes bakterirakkudes hõljuvad DNA-ribad, mida saab muuta teatud tüüpi DNA-ks – üheks DNA-ahelaks, mida nimetatakse ssDNA-deks (jah, see on imelik). Kuid see on geenide redigeerimise jaoks fantastiline uudis, sest meie rakkude DNA muutub jagamisel üksikuteks ahelateks. Ideaalne ajastus retroni vahetamiseks ja söödaks.

Tavaliselt eksisteerib meie DNA topeltheeliksides, mis on tihedalt mähitud 23 kimpu, mida nimetatakse kromosoomideks. Iga kromosoomikimp on kahes eksemplaris ja kui rakk jaguneb, eralduvad koopiad, et end dubleerida. Selle aja jooksul vahetavad kaks koopiat mõnikord geene protsessis, mida nimetatakse rekombinatsiooniks. See on siis, kui retronid saavad sisse hiilida, sisestades selle asemel oma ssDNA järglased jagunevatesse rakkudesse. Kui nad kannavad uusi nippe – näiteks võimaldavad bakterirakul muutuda ravimite suhtes resistentseks – ja end edukalt sisestavad, pärivad raku järglased selle tunnuse.

Raku loomuliku masinavärgi tõttu võivad retronid tungida genoomi ilma seda lõikamata. Ja nad saavad seda teha samaaegselt miljonites jagunevates rakkudes.

"Arvasime, et retronid peaksid andma meile võimaluse toota ssDNA-d rakkudes, mida me tahame muuta, selle asemel, et püüda neid rakku väljastpoolt sundida ja kahjustamata natiivset DNA-d, mis mõlemad olid väga veenvad omadused," ütles uuring. autor dr Daniel Goodman.

RTR-i tegemine

Sarnaselt CRISPR-iga on RTR-il mitu komponenti: geenijupp, mis sisaldab mutatsiooni (sööt) ja kaks valku, RT ja SSAP (pöördtranskriptaas ja üheahelalised anniilimisvalgud), mis muudavad retroni ssDNA-ks ja lasevad sellel end sisestada. jagunevaks rakuks.

Ikka koos minuga?

Nagu ka Game of Thrones, on seal palju mängijaid. Et asi oleks selgem: retronid kannavad geneetilist koodi, mida tahame sisestada; RT muudab selle ühilduvamaks vormiks, mida nimetatakse ssDNA-ks; ja SSAP kleebib selle jagunemisel DNA-sse. Põhimõtteliselt tungib Trooja hobune rakku ja valab ensümaatiliste mustkunstnike abiga välja spioonid, kes sisestavad end rakku – muutes selle DNA-d.

Kaks valku on erakonna jaoks uued. Varem on teadlased püüdnud geenide redigeerimiseks kasutada retroneid, kuid efektiivsus oli äärmiselt madal – umbes 0.1 protsenti nakatunud bakterirakkudest. Kaks uustulnukat vaigistasid bakterite loomuliku "häiresüsteemi", mis parandab DNA muutusi – nii et nad eiravad uusi DNA bitte – ning võimaldavad muudatustel siseneda ja edasi anda järgmisele põlvkonnale. Veel üks trikk oli kahe geeni steriliseerimine, mis kodeerivad valke, mis tavaliselt hävitavad ssDNA-d.

Ühes testis leidis meeskond, et üle 90 protsendi bakterirakkudest võttis uue retronijärjestuse hõlpsasti oma DNA-sse. Järgmisena läksid nad suureks. Võrreldes CRISPR-iga on retronitel jalg püsti, kuna nende järjestus võib toimida vöötkoodina. See tähendab, et on võimalik teha korraga mitu geenide redigeerimise katset ja vöötkoodi järjestamise abil välja selgitada, milliseid rakke millise retroniga redigeeriti.

Kontseptsiooni tõestamise testis lõi töörühm mõned bakterirakud retronitega, mis sisaldasid antibiootikumiresistentsuse järjestusi. Ainuüksi antibiootikumidega töödeldud bakterite kogumi retronite DNA tähtede sekveneerimisel avastasid nad, et retronitega rakud – andes neile uue superjõu ravimite vastu – säilisid palju suuremates osades kui teised rakud.

Teises testis püüdis meeskond kindlaks teha, kui palju retroneid nad saavad korraga kasutada. Nad võtsid teise bakteritüve, mis on antibakteriaalsete ainete suhtes resistentne, ja tükeldasid selle genoomi, et luua kümnetest miljonitest retronitest koosnev raamatukogu. Seejärel torkasid nad need tükid DNA hularõngastesse, mida nimetatakse plasmiidideks, ja ujutasid need bakterirakkudesse. Nagu varemgi, suutis meeskond hõlpsasti leida retroneid, mis andsid antibakteriaalset väge, järjestades ellu jäänud vöötkoodid.

Aga miks?

See on see, kuidas. Aga mis on põhjus?

Eesmärk on lihtne: leida CRISPR-ile teine ​​lahendus, mis võib mõjutada miljoneid rakke korraga, ilma rakke kahjustamata. Teisisõnu, viige geenide redigeerimine läbi mitme põlvkonna suurandmete ajastusse.

Võrreldes CRISPR-iga on uus RLR-tööriist lihtsam, kuna see ei vaja lisaks redigeerimistööriistale ka "juhendi" tööriista - retron on põhimõtteliselt kaks-ühes. Võimalus mõjutada mitut geeni korraga – ilma nendesse füüsiliselt lõikamata – muudab selle ka sünteetilise bioloogia jaoks intrigeerivaks tööriistaks. Tööriistal on ka püsiv jõud. "Üks ja tehtud" CRISPR-eetose asemel kestab see rakkude jagunemisel põlvkondade kaupa.

See tähendab, et RTR-il on konkurents. Kuna see toimib kõige paremini jagunevate rakkudega, ei pruugi see olla nii võimas vastumeelsetes rakkudes, mis keelduvad jagunemast, näiteks neuronites. Teiseks on hiljutised CRISPR-i versiooniuuendused võimaldanud ka geene sisse või välja lülitada - ilma neid lõikamata - läbi epigeneetika.

Kuid RLR pakub ulatust. "Võimalus analüüsida ühendatud vöötkoodiga mutantide raamatukogusid RLR-iga võimaldab samaaegselt läbi viia miljoneid katseid, võimaldades meil jälgida mutatsioonide mõju kogu genoomis ja ka seda, kuidas need mutatsioonid võivad üksteisega suhelda," ütles Church.

Image Credit: Pete Linforth Alates Pixabay

Allikas: https://singularityhub.com/2021/05/11/a-new-gene-editing-tool-rivals-crispr-and-can-make-millions-of-edits-at-once/