Virusten ja virusvarianttien samanaikainen tunnistaminen ohjelmoitavan DNA-nanosyötin avulla

Potilasnäytekeräys

Potilasnäytteet kerättiin pyyhkäisemällä potilaiden kurkun takaosaa (suunielun vanupuikko), kuten aiemmin on kuvattu²⁶. Näytteet kerättiin potilailta, joilla oli COVID-19:n kaltainen kliininen kuva, ja ne testattiin qRT-PCR:llä nukleiinihappouuton jälkeen. Lyhyesti, pyyhkäisynäytteet laitettiin keräyksen jälkeen leimattuihin näyteputkeen, joka sisälsi lyysipuskuria (4 M guanidiinitiosyanaattia, 25 mM Tris-HCl:a, 0.5 % β-merkaptoetanolia ja MS2-RNA:ta (200 ng µl).^-1; Roche)). Putkea sekoitettiin varovasti lyysipuskurin tasaisen jakautumisen varmistamiseksi. Turvatoimenpiteet on kuvattu aiemmin ja ne suoritettiin sertifioidussa CL2-laboratoriossa²⁶.

Nukleiinihapon uuttaminen

Kokonaisnukleiinihappo uutettiin spin-kolonnipohjaisilla järjestelmillä ja standardoidussa qRT-PCR-testauksessa.²⁶. Sisäinen vahvistussäätö (MS2 (~6 × 10⁴ PFU ml^-110 ml:aa lyysipuskuria kohti) lisättiin täydentävään lyysipuskuriin (25 ui per 10 ml lyysipuskuria). Näyte eluoitiin 100 µl:ssa nukleaasivapaata vettä (nfH₂O; Invitrogen) ja jätetään seisomaan 1 minuutti ennen sentrifugointia 1 minuutin ajan 21,130 XNUMX ×g (15,000 80 rpm) pöytämikrofuugissa. Eluoidut näytteet altistettiin suoraan qRT-PCR:lle. Loput nukleiinihappouutteet säilytettiin -XNUMX °C:ssa ja niitä käytettiin edelleen nanosyötti-nanohuokosten havaitsemiseen.

qRT-PCR SARS-CoV-2:lle

SARS-CoV-2-tunnistus suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla²⁶. Reaktiota kohden perusseos sisälsi 12.5 µl 2× Luna Universal Probe One-Step -reaktioseosta, 0.5 µl 20 µM Wu eteenpäin suuntautuvaa aluketta (5'-ATGGGTTGGGATTATCCTAAATGTGA-3'), 0.5 µl 20 uM reverse-aluketta. -GCAGTTGTGGCATCTCCTGATGAG-5'), 3 µl 0.3 µM MGB Probe 10 fluoreseiinia (3'-ATGCTTAGAATTATGGCCTCAC-5'), 3 µl 0.5 µM sisäisen kontrollin reverse-RNA:ta varten 10 MS2, eteenpäin aluketta, l 0.5.MS10-forward-aluketta varten. MS2 RNA, 0.3 µl 10 µM sisäistä koetinta (MS2 ROX), 1 µl Luna WarmStart RT Enzyme Mixiä ja 3.9 µl nfH:ta₂O. Sitten 20 ui perusseosta jaettiin 96-kuoppaisen levyn jokaiseen kuoppaan ja yhdistettiin sitten 5 ul:aan kutakin uutetta. MS2:n sisäinen uutto- ja monistuskontrolli, jolle tehtiin täydellinen uuttoprotokolla, sisällytettiin negatiiviseksi uuttokontrolliksi vähintään kahteen kuoppaan qRT-PCR-levyllä. Mahdollisen kontaminaation määrittämiseksi qRT-PCR-prosessissa 5 µl nfH₂O sisällytettiin negatiiviseksi qRT-PCR-kontrolliksi. Sitten 5 ui piikkimäistä SARS-CoV-2-templaattiplasmidia sisällytettiin yhteen kuoppaan qRT-PCR-positiivisena kontrollina. Kun oli lisätty 5 ui kutakin näytettä sille määrättyyn kuoppaan, levy suljettiin optisesti kirkkaalla muovitiivisteellä. Levyä sentrifugoitiin 1 minuutin ajan 2,000 XNUMX x nopeudellag (1,000 4 rpm) 2 °C:ssa ja asetettiin sitten qRT-PCR-laitteeseen (QuantStudio, Thermo Fisher Scientific) ja ajo parametrisoitiin. Signaalit fluoreseiinille (FAM) ja karboksirodamiinille (ROX) hankittiin. ROXia käytettiin sisäisen MS2-kontrollin havaitsemiseen ja fluoreseiinia käytettiin SARS-CoV-2-RNA:n havaitsemiseen. Määritys suoritettiin 25 minuuttia 15 °C:ssa, 50 minuuttia 2 °C:ssa (käänteiskopioijalle), 90 minuuttia 45 °C:ssa, ennen 95 sykliä 3 °C:ssa 60 sekunnin ajan ja sen jälkeen 30 °C:ssa 2 sekunnin ajan. . Tulokset määritettiin vahvistamalla oikeat positiiviset kontrollit (plasmidin monistus), kaikkien näytteiden uutto- ja monistuskontrollit (ROX-kanava), ei amplifikaatiota negatiivisissa kontrolleissa ja kontrollien yhdenmukaiset keskiarvot. SARS-CoV-36-positiivisuus varmistettiin amplifikaatiolla fluoreseiinikanavassa sopivalla sigmoidikäyrällä CT-arvon ollessa ≤2. MS3- ja MGB-koettimen XNUMX CT-arvoja pidettiin yllä määrityksen laadun ja toistettavuuden seuraamiseksi.⁴⁴.

Ohjelmoitava RNase H -leikkaus nanosyötille

Nanohuokosten havaitsemiseen käytettiin edelleen SARS-CoV-2-RNA-kontrolleja, nukleiinihappouutteita (potilasnäytteitä) tai MS2-virus-RNA:ta havaitsemiseen nanosyötillä. Ensin sekoitettiin näytteeseen ohjausoligoja ja kuumennettiin 70 °C:seen 5 min. RNaasi H (5,000 20 yksikköä/ml; NEB) lisättiin, sekoitettiin ja kuumennettiin 37 minuuttia 65 °C:ssa, jotta entsyymi pystyi leikkaamaan RNA:ta DNA:ssa: RNA-hybridi, joka vapauttaa tehokkaasti kohde-RNA:n. RNaasi H inaktivoitiin termisesti inkuboimalla 10 °C:ssa XNUMX minuutin ajan. Ohjausoligot validoitiin siten, että ne eivät muodosta molekyylinsisäisiä rakenteita, homo- tai heterodimeerejä käyttämällä NUPACK-ohjelmistoa⁴⁵. Mittaukseen poissa olevan kohteen kanssa käytettiin samaa protokollaa, joka sisälsi ohjausoligoja. Kontrollimittaukset eivät osoita siirtymää, ja näin ollen voimme sulkea pois kaikki olennaiset ristisitoutumiset ohjausoligoista.

Viruksen kohdesekvenssin ominaisuudet nanosyötille

Kohteen pituus, varpaanpituus ja GC-pitoisuus valittiin optimaalisen hybridisaation varmistamiseksi²¹. DNA-nanosyöttimalleja varten kohdesekvenssit valittiin olemaan virusgenomin konservoituneilla alueilla ja niiden GC-pitoisuus oli 40–60 % vakaan 20 bp:n dupleksin muodostamiseksi. Varpaan pituudeksi valittiin 6 nt pitkä ja 40–60 % GC-pitoisuus. Testasimme kaikki sekvenssit mahdollisten ei-toivottujen erittäin stabiilien molekyylinsisäisten vuorovaikutusten tai homodimeerien varalta NUPACK-ohjelmistolla (verkkosovellus 2020)⁴⁵. Sitten suoritimme ristireaktiivisuustarkistuksen useiden kussakin kokeessa käytettyjen paikkojen välillä⁴⁵.

DNA-kukan valmistelu nanosyöttiä varten

Suunnittelimme DNA-kukan toiseksi etiketiksi SARS-CoV-2-RNA:n havaitsemiseen potilasnäytteistä. Kolme DNA-kukkaa, jotka olivat spesifisiä kullekin SARS-CoV-2-kohteelle (seitsemänsuuntaiset liitokset, 7WJa, 7WJb ja 7WJc), valmistettiin erikseen. Esimerkkinä 7WJc, 4 μM DNA-juoste J1, J2, J3 ja J4c (lisätaulukko 1) sekoitettiin yhteen TM-puskurissa (10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl₂, pH 8.0) ja kuumennettiin 90 °C:seen 5 minuutiksi, sitten jäähdytettiin 65 °C:seen 15 minuutiksi, 45 °C:seen 15 minuutiksi, 37 °C:seen 20 minuutiksi, 25 °C:seen 20 minuutiksi ja lopuksi 4 °C:seen C 20 min. Säie J4c korvattiin J4b:llä 7WJb:n valmistamiseksi. 7WJa:lle, jotta vältetään itselaskostuminen nanosyötin kohdassa 43, J1, J2, J3 J4a ja C43 sekoitettiin keskenään ennen lämpökäsittelyä.

DNA-nanosyötin itsekokoonpano

DNA-nanosyötti koottiin sekoittamalla linearisoitua yksijuosteista M13-DNA:ta (M13mp18, 7,249 100 nt, Guild Biosciences, XNUMX nM) lyhyiden komplementaaristen oligonukleotidien kanssa¹² (joista jotkin sisälsivät vertailurakenteita ja sieppaussäikeitä) ja lisäämällä osittain komplementaarisia juosteita, jotka oli 3'-biotinyloitu varvaspitovälitteisen juosteen syrjäytysreaktiota varten. Linearisoitua M13-DNA:ta (pituus 7,228 XNUMX nt) täydennettiin oligonukleotideilla, jolloin syntyi kaksisäikeinen nanosyötti, jossa oli kaksipääteistä neljä deoksitymidiiniylijännettä, jotka estävät multimerisoitumisen¹². Seos sisälsi 20 nM linearisoitua M13 DNA:ta, 60 nM oligonukleotideja (kolme kertaa ylimäärä M13 DNA:han verrattuna), 3'-biotinyloituja juosteita pitoisuutena 180 nM, 10 mM MgCl₂ ja 1 x TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0). Se sekoitettiin pipetoimalla ja sentrifugoitiin ennen kuumennusta 70 °C:seen 30 sekunniksi ja jäähdytettiin 45 minuutin aikana ympäristön lämpötilaan. Ylimääräiset oligonukleotidit poistettiin käyttämällä Amicon Ultra 0.5 ml:n keskipakosuodattimia 100 kDa:n rajalla pesupuskurilla (10.0 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.5 mM MgCl).₂). Jos DNA-kukkia käytettiin leimana, sitä kantavia osittain komplementaarisia juosteita inkuboitiin 10 mM MgCl:ssa₂ 2 tunnin ajan ympäristön lämpötilassa ja sen jälkeen Amicon-suodatus suoritettiin edellä kuvatulla tavalla. Nanosyöttisuunnittelun epäsymmetria mahdollistaa sitoutumiskohtien yksiselitteisen tunnistamisen. Nanosyöttiä säilytettiin jatkokokeisiin asti 4–10 °C:ssa 0.5 mM MgCl:ssa.₂10.0 mM Tris-HCl, pH 8.0. Nanosyötin suunnittelu tarkistettiin nanohuokoslukemalla ennen jokaista mittausta.

DNA-nanosyötin nanohuokosluku

Nanosyötti sekoitettiin näytteen kanssa (nukleiinihappouute tai puhdistetut viruskohteet kymmenkertaisena ylimääränä) 10 mM MgCl:ssa₂ ja 100 mM NaCl. Seosta (5 μl) inkuboitiin huoneenlämmössä (~ 10 min), kunnes se valmistettiin nanohuokosmittausta varten. Ero kohdesekvenssin koostumuksessa ja sen fysikaalisissa ominaisuuksissa saattaa johtaa vaihteluun hybridisaatiossa ja siten tunnistuskohtien syrjäytystehokkuuteen²¹. Olemme käyttäneet htRNA:ta (100 ng μl^-1; Invitrogen) taustana, kun se on osoitettu, osoittamaan, ettei ihmisen natiivi RNA:iden indusoimia epäspesifisiä signaaleja ole. Nanohuokosmittausta varten näyte laimennettiin <0.5 nM nanosyöttiin (puhdistetut viruskohteet) tai 4.7 μl RNase-H-leikattua potilasnäytettä sekoitettiin 0.3 μl:aan yksiarvoista streptavidiinia (SAe1D3).¹⁸ (1 μM), 5 μl LiCl (4.0 M) ja 5.0 μl LiCl (8.0 M). Olemme valmistaneet 14 ± 3 nm (keskiarvo ± standardipoikkeama) nanohuokosia¹² käyttäen kvartsilasikapillaareja, joiden ulkohalkaisija on 0.5 mm ja sisähalkaisija 0.2 mm (Sutter Instrument) laseravusteisella vedin P-2000 (Sutter Instrument). Seos pipetoitiin nanohuokoiseen polydimetyylisiloksaanisiruun ja kaikki mittaukset suoritettiin vakiojännitteellä 600 mV. Nanopore-mittaustiedot on esitetty lisätaulukossa 30.

Reaaliaikainen nanohuokostietojen analyysi

Nanopore-tietojen analyysi selitetään yksityiskohtaisesti lisäosassa 14. Lyhyesti sanottuna nanosyöttitapahtumat suodatettiin pois raa'ista ionivirtajäljistä ja sitten määritettiin havaitsemisalue, ja informaatio piikin läsnäolosta kussakin tietyssä paikassa erotettiin. Piirretty siirtymätehokkuus laskettiin siirtymätehokkuudena mittaukselle, josta on vähennetty kunkin kohteen ei-kohdekontrolli (50 nanosyöttitapahtumaa jokaisessa kolmessa nanohuokoisessa tallenteessa), ellei toisin mainita:

Vahvistimme, että konvoluutiohermoverkko QuipuNet²⁷ pystyi nanohuokostietojen reaaliaikaiseen analyysiin kuvattua menettelyä noudattaen. Aiemmin osoitimme, että noin kymmenellä tapahtumalla saavutamme 99 prosentin varmuuden suunnittelemiemme DNA-rakenteiden positiiviseen havaitsemiseen.⁴⁶.

AFM-kuvaus

AFM (Nanosurf Mobile S) -kuvaus nanosyötteistä suoritettiin ilmassa kosketuksettomassa tilassa. Nanosyöttirakenteet laimennettiin 1 ng μl:aan^-1 1 mM MgCl:ssa₂ ja 10 μl lisättiin juuri pilkottuun kiilleen, inkuboitiin 1 minuutti, huuhdeltiin suodatetulla Milli-Q-vedellä ja puhalluskuivattiin sitten typellä. Ennen skannausta kiillelevy kiinnitettiin AFM-näyteasteeseen käyttämällä kaksipuolista teippiä. Kuvan visualisointi ja analyysi suoritettiin Gwyddionilla (versio 2.60).

Tilastollinen analyysi

Kaikille mittauksille laskettiin 99.9 %:n luottamusvälit siirtymätehokkuuksille. Tilastollinen merkitsevyys kahden kohteen välillä ilman kohdetta ja kohteen kanssa testattiin käyttämällä kaksipuolista Studentin testiä t-testata.

Raportointiyhteenveto

Lisätietoja tutkimussuunnittelusta on saatavana Nature Portfolio Reporting Summary linkitetty tähän artikkeliin.

• SEO-pohjainen sisällön ja PR-jakelu. Vahvista jo tänään.
• Platoblockchain. Web3 Metaverse Intelligence. Tietoa laajennettu. Pääsy tästä.
• Lähde: https://www.nature.com/articles/s41565-022-01287-x