Strumenti per la nanotecnologia del DNA: dalla progettazione alle applicazioni: attuali opportunità e collaborazioni – Wyss Institute

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Suite di dispositivi nanotecnologici del DNA progettati per superare specifici colli di bottiglia nello sviluppo di nuove terapie, diagnostica e comprensione delle strutture molecolari

Inventori principali

William Shih WesleyWong

Vantaggi

Il DNA come elementi costitutivi
Ampie applicazioni
Basso costo con grande potenziale

Strumenti per la nanotecnologia del DNA: dalla progettazione alle applicazioni

Le nanostrutture di DNA con il loro potenziale di permeabilità cellulare e tissutale, biocompatibilità ed elevata programmabilità a livello di nanoscala sono candidati promettenti come nuovi tipi di veicoli per la somministrazione di farmaci, dispositivi diagnostici altamente specifici e strumenti per decifrare come le biomolecole cambiano dinamicamente le loro forme e interagiscono con tra loro e con i farmaci candidati. I ricercatori del Wyss Institute stanno fornendo una suite di strumenti nanotecnologici del DNA diversificati e multifunzionali con capacità e potenziale unici per un'ampia gamma di aree di ricerca clinica e biomedica.

Dispositivi nanotecnologici a DNA per la somministrazione di farmaci terapeutici

Le nanostrutture di DNA hanno il potenziale futuro per essere ampiamente utilizzate per trasportare e presentare una varietà di molecole biologicamente attive come farmaci, antigeni e adiuvanti che potenziano il sistema immunitario per colpire cellule e tessuti nel corpo umano.

Origami di DNA come componenti di somministrazione ad alta precisione dei vaccini contro il cancro

Il Wyss Institute si è sviluppato vaccini contro il cancro per migliorare le immunoterapie Questi approcci utilizzano scaffold impiantabili o iniettabili basati su biomateriali che presentano antigeni tumore-specifici e biomolecole che attraggono le cellule immunitarie dendritiche (DC) nello scaffold e le attivano in modo che dopo il loro rilascio possano orchestrare le risposte delle cellule T antitumorali contro i tumori portatori degli stessi antigeni. Per essere attivate nel modo più efficace, le DC probabilmente hanno bisogno di sperimentare antigeni tumorali e molecole adiuvanti CpG immunostimolanti in rapporti particolari (stechiometrie) e configurazioni che si registrano con la densità e la distribuzione delle molecole recettoriali sulla loro superficie cellulare.

Sviluppato appositamente Origami di DNA, programmati per assemblarsi in blocchi rigidi di reticolo quadrato che gli antigeni tumorali e gli adiuvanti delle DC all'interno di scaffold biomateriali con precisione su scala nanometrica sono co-presenti e hanno il potenziale per aumentare l'efficacia dei vaccini terapeutici contro il cancro e possono essere ulteriormente funzionalizzati con farmaci antitumorali.

Strategia di modificazione chimica per proteggere le nanostrutture del DNA che rilasciano farmaci

Le nanostrutture del DNA, come gli origami di DNA autoassemblanti, sono veicoli promettenti per la distribuzione di farmaci e strumenti diagnostici. Possono essere funzionalizzati in modo flessibile con farmaci a piccole molecole e proteine, nonché con caratteristiche che ne facilitano il rilascio a cellule e tessuti bersaglio specifici. Tuttavia, il loro potenziale è ostacolato dalla loro limitata stabilità nei tessuti e nel sangue del corpo. Per contribuire a realizzare la straordinaria promessa delle nanostrutture del DNA, i ricercatori Wyss hanno sviluppato un approccio di reticolazione chimica semplice, efficace e scalabile che possono fornire alle nanostrutture di DNA la stabilità di cui hanno bisogno come veicoli efficaci per farmaci e diagnostica.

In due semplici passaggi economicamente vantaggiosi, l'approccio di Wyss utilizza innanzitutto a agente neutralizzante discreto e di piccole dimensioni, PEG-oligolisina, che trasporta molteplici cariche positive, per coprire le strutture degli origami del DNA. A differenza del Mg comunemente usato²⁺ioni che neutralizzano ciascuno solo due cambiamenti negativi nelle strutture del DNA, la PEG-oligolisina copre più cariche negative contemporaneamente, formando così una “rete elettrostatica” stabile che aumenta la stabilità delle nanostrutture del DNA di circa 400 volte. Quindi, applicando a reticolazione chimica reagente noto come glutaraldeide, nella rete elettrostatica vengono introdotti ulteriori legami stabilizzanti, che aumentano la stabilità delle nanostrutture di DNA di altre 250 volte, estendendo la loro emivita in un intervallo compatibile con un'ampia gamma di applicazioni cliniche.

Dispositivi nanotecnologici del DNA come strumenti diagnostici e analitici ultrasensibili

La generazione di nanostrutture di DNA rilevabili in risposta a una malattia o di acidi nucleici specifici del patogeno offre, in linea di principio, un mezzo per il rilevamento altamente efficace di biomarcatori in diversi campioni. Un evento di legame di una singola molecola di un oligonucleotide sintetico a un acido nucleico bersaglio può innescare la creazione di strutture molto più grandi mediante l'assemblaggio cooperativo di unità di DNA sintetico più piccole come piastrelle o mattoni di DNA in strutture più grandi che possono quindi essere visualizzate in semplici analisi di laboratorio. Tuttavia, un ostacolo centrale a questi approcci è il verificarsi di (1) eventi di legame non specifico e (2) di nucleazione non specifica in assenza di un acido nucleico bersaglio specifico che possono portare a risultati falsi positivi. I nanotecnologi del DNA di Wyss hanno sviluppato due soluzioni applicabili separatamente ma combinabili per questi problemi.

Conteggio digitale di molecole biomarker con catenani di DNA nanoswitch

Per consentire il rilevamento iniziale (legame) di biomarcatori con sensibilità e specificità ultra elevate, i ricercatori Wyss hanno sviluppato un tipo di nanointerruttore del DNA che, progettato come un catenano più grande (latino Catenache significa catena), è assemblato da sottostrutture a forma di anello interconnesse meccanicamente con funzionalità specifiche che insieme consentono il rilevamento e il conteggio di singole molecole di biomarcatori. Nella struttura “DNA Nanoswitch Catenane”, entrambe le estremità di un filamento di DNA sintetico più lungo sono collegate a due frammenti di anticorpo che legano ciascuno specificamente parti diverse della stessa molecola biomarcatrice di interesse, consentendo così un’elevata specificità e sensibilità del bersaglio.

Questo evento ponte fa sì che il filo si chiuda in un “anello ospite”, che è interconnesso in diverse regioni con diversi “anelli ospiti”. La chiusura dell'anello ospite trasforma gli anelli ospiti in una configurazione che consente la sintesi di un nuovo filamento di DNA. Il filamento diagnostico appena sintetizzato può quindi essere rilevato in modo inequivocabile come conteggio di una singola molecola digitale, mentre la distruzione del complesso frammento di anticorpo/biomarcatore avvia un nuovo ciclo di conteggio del biomarcatore. Sia la specificità di legame del bersaglio che la sintesi di un filamento di DNA specifico per il bersaglio consentono anche la combinazione di più catenani di nanoswitch del DNA per contare simultaneamente diverse molecole di biomarcatori in un'unica reazione multiplex.

Per la diagnostica ultrasensibile, è auspicabile avere l'amplificazione più rapida e il tasso più basso di nucleazione spuria. Gli approcci nanotecnologici del DNA hanno il potenziale per raggiungere questo obiettivo in modo privo di enzimi e a basso costo.

WILLIAM SHIH

Una piattaforma di amplificazione rapida per diversi biomarcatori

A piattaforma di rilevamento e amplificazione rapida, economica e priva di enzimi evita la nucleazione e l'amplificazione non specifica e consente l'autoassemblaggio di strutture su scala micrometrica molto più grandi da un singolo seme in pochi minuti. Il metodo, denominato “Rilevamento incrociato di nanoseed" consente l'assemblaggio ultra-cooperativo di nastri a partire da un singolo evento di legame del biomarcatore. Le strutture su scala micrometrica sono densamente intrecciate da "doghe di DNA" a filamento singolo, per cui una lamella in entrata serpeggia sopra e sotto sei o più lamelle precedentemente catturate su un'estremità del nastro in crescita in modo "incrociato", formando interazioni deboli ma altamente specifiche con le sue lamelle di DNA interagenti. La nucleazione del processo di assemblaggio è strettamente specifica per il seme bersaglio e l'assemblaggio può essere effettuato in una reazione in una sola fase in circa 15 minuti senza l'aggiunta di ulteriori reagenti e in un ampio intervallo di temperature. Utilizzando apparecchiature di laboratorio standard, le strutture assemblate possono quindi essere rapidamente visualizzate o rilevate in altro modo, ad esempio utilizzando test con lettori di piastre a fluorescenza ad alto rendimento.

OPPORTUNITÀ ATTUALE – STARTUP

Rilevamento incrociato di nanoseed: diagnostica delle malattie infettive basata sulla nanotecnologia

Nanotecnologia del DNA senza enzimi per il rilevamento rapido, ultrasensibile e a basso costo di biomarcatori di malattie infettive con ampia accessibilità nei punti di cura.

Il processo di assemblaggio del DNA nel metodo Crisscross Nanoseed Detection può anche essere collegato all'azione dei catenani di nanoswitch del DNA che rilevano in modo altamente specifico una molecola biomarker portando alla conservazione di un record molecolare. Ogni record sopravvissuto può nucleare l'assemblaggio di una nanostruttura incrociata, combinando il legame ad alta specificità con l'amplificazione per il rilevamento dei biomarcatori.

I ricercatori di Wyss stanno attualmente sviluppando l’approccio come strumento diagnostico multiplexable a basso costo per il virus SARS-CoV-19 che causa il COVID-2 e altri agenti patogeni che potrebbe fornire risultati accurati più velocemente e a costi inferiori rispetto alle tecniche attualmente utilizzate.

Dispositivi su scala nanometrica per determinare la struttura e l'identità delle proteine a livello di singola molecola

La capacità di identificare e quantificare le proteine da campioni biologici in tracce avrebbe un profondo impatto sia sulla ricerca di base che sulla pratica clinica, dal monitoraggio dei cambiamenti nell’espressione proteica all’interno delle singole cellule, alla possibilità di scoprire nuovi biomarcatori di malattia. Inoltre, la capacità di determinarne anche le strutture e le interazioni aprirebbe nuove strade per la scoperta e la caratterizzazione dei farmaci. Negli ultimi decenni, gli sviluppi nell’analisi e nel sequenziamento del DNA hanno senza dubbio rivoluzionato la medicina, ma sviluppi equivalenti per l’analisi delle proteine sono rimasti una sfida. Sebbene metodi come la spettrometria di massa per l'identificazione delle proteine e la crioEM per la determinazione della struttura abbiano fatto rapidi progressi, permangono sfide relative alla risoluzione e alla capacità di lavorare con campioni eterogenei in tracce.

Per contribuire ad affrontare questa sfida, i ricercatori del Wyss Institute hanno sviluppato un nuovo approccio che combina la nanotecnologia del DNA con la manipolazione di singole molecole per consentire l’identificazione strutturale e l’analisi di proteine e altre macromolecole. I “DNA Nanoswitch Calipers” (DNC) offrono un approccio ad alta risoluzione alle “proteine dell’impronta digitale” misurando le distanze e determinando le geometrie all’interno delle singole proteine in soluzione. I DNC sono nanodispositivi progettati per misurare le distanze tra le maniglie del DNA che sono state attaccate alle molecole bersaglio di interesse. Gli stati DNC possono essere attivati e letti utilizzando Spettroscopia di forza di singola molecola, consentendo di effettuare misurazioni multiple di distanza assoluta su ogni singola molecola.

I DNC potrebbero essere ampiamente adattati per far avanzare la ricerca in diverse aree, tra cui la biologia strutturale, la proteomica, la diagnostica e la scoperta di farmaci.

Tutte le tecnologie sono in fase di sviluppo e disponibili per collaborazioni di settore.

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