דגימות אנושיות
רקמות FFPE נאספו על פי פרוטוקולים מוסדיים. דגימות הביקורת של הכליות נאספו בשיתוף עם המחלקה לנפרולוגיה ואימונולוגיה קלינית, אוניברסיטת RWTH Aachen. ביופסיות כליה מחולים עם MCD ו-IgAN התקבלו ממרשם הגלומרולונפריטיס של המבורג (https://www.sfb1192.de/en/register). אישורים אתיים התקבלו מוועדת הביקורת המוסדית של המרכז הרפואי האוניברסיטאי RWTH Aachen (EK-016/17); ה-Ethik-Commission der Ärztekammer Hamburg; וועדת האתיקה המקומית של לשכת הרופאים בהמבורג (PV4806). כולם בהתאם לעקרונות האתיים שנקבעו בהצהרת הלסינקי.
בנוסף, דגימות מחולים עם גליובלסטומה וAD סופקו על ידי המכון לנוירופתולוגיה, המרכז הרפואי האוניברסיטאי המבורג-אפנדורף. המחקר נבדק על ידי ועדת האתיקה של לשכת הרופאים בהמבורג (WF72/17). דגימה משליה אנושית סופקה על ידי המחלקה לרפואת עובר-אם ניסויית, המחלקה למיילדות ורפואת עוברים, המרכז הרפואי האוניברסיטאי המבורג-אפנדורף, ואושרה על ידי לשכת הרופאים של המבורג (PV7312).
דגימות Murine
FFPE מח עצם תקין של עכברים סופק על ידי המחלקה לביולוגיה התפתחותית ומכון Oncode במכון הסרטן של המרכז הרפואי Erasmus. איסוף הרקמות אושרו על ידי ועדת רווחת בעלי חיים/אתיקה של ה-EDC בהתאם לחקיקה בהולנד (AVD1010020173387).
רקמת כליה עכברת ביקורת ורקמת IRI ניסיונית נאספו במחלקה לרפואה, המרכז הרפואי האוניברסיטאי המבורג-אפנדורף. כל ההליכים בוצעו באישור בית החולים האוניברסיטאי המבורג-אפנדורף ומחלקת המדינה של המבורג לרווחת בעלי חיים במסגרת בקשה מס. N002/2020. הרדמת עכברים: 30 דקות לפני הניתוח, 0.05 mg kg-1 בופרנורפין הוזרק תת עורית. בזמן הניתוח, נרקוזיס הושרה ונשמר באמצעות איזופלורן (5% איזופלורן ב-O טהור2 לאינדוקציה, 2% איזופלורן ב-O2 לצורך תחזוקה). אינדוקציה של IRI: עכברים הורדמו והונחו על כרית חימום (39 מעלות צלזיוס). הבטן נפתחה באמצעות לפרוטומיה חציונית ועורק הכליה של הכליה הימנית הוצמד למשך 30 דקות (מיקרו-סרפין מהדק, Fine Science Tools; 18055-03). הבטן הייתה מלאה ב-0.9% NaCl ונסגרה זמנית באמצעות Parafilm (Bemis). לאחר זמן זה הוסר המהדק, הבטן נסגרה באמצעות תפר 3.0 וההרדמה הופסקה. בעלי חיים הוכנסו בחזרה לכלובים שלהם והייתה להם גישה חופשית למאכל רך ומים, ממותקים (שמונה טיפות של Natreen Classic) בתוספת מטמיזול (1.3 mg ml.-1, Ratiopharm). נקודת סיום: לאחר 24 שעות, הרדמה שוב מושרה, והבטן נפתחה. כלי בטן נחשפו, וזלוף הכליה נקבע דרך אבי העורקים הבטן באמצעות 4% פרפורמלדהיד ב-1× פוספט-buffered מלח (PBS) ב-200 mmHg למשך 5 דקות. הכליות נקצרו ואוחסנו ב-4% PFA בטמפרטורה של 4 °C עד לניתוח נוסף.
המעי הגס של המוח הושג מבקרות וממודל ניסיוני של קוליטיס. כל ההליכים בוצעו באישור בית החולים האוניברסיטאי המבורג-אפנדורף ומחלקת המדינה של המבורג לרווחת בעלי חיים במסגרת בקשה מס. TVA17/13. עכברים שוכנו בתנאים ספציפיים ללא פתוגנים בכלובים מאווררים בנפרד עם מזון ומים סטנדרטיים מודעה. נעשה שימוש בעכברים מסוג B6 תואמי גיל ומין בין 8 ל-12 שבועות. במהלך ניסויים, העכברים נוטרו מדי יום. לעכברים מקבוצת התערבות האכילו 1.8% מלח DSS (MP Biomedicals; משקל מולקולרי, 36,000-50,000 Da) במי שתייה במשך 7 ימים כדי לגרום לקוליטיס, בעוד לעכברי ביקורת הוזנו מים רגילים41.
רקמות ארכיון ממודל ניסיוני של GBM משובש התקבלו מניסוי קודם. הדור של קו עכברים זה תואר בפרסום המקורי, יחד עם אישור אתי של Regierungspräsidium Freiburg (G16-122) ו-BGV Hansestadt Hamburg (Ü 004/2018).
הסרת שעווה והחזרת אנטיגן
חתכי פרפין נחתכו בעובי של 2-4 µm והותקנו על שקופיות Superfrost Plus. לאחר מכן, כל הדגימות הוטבלו ברצף בקסילן 3× (10 דקות כל אחת) ואחריה סדרת אתנול (5 דקות כל אחת) של 3× 100%, 2× 70%, 1× 50% ולבסוף 3× (5 דקות כל אחת) ) במים כפולים דה-יונים. שליפת אנטיגן בוצעה עם Agilent DAKO Target Retrieval Solution ב-pH 9 (מספר קטלוג S236884-2) בסיר קיטור Braun Multiquick FS20 למשך 15 דקות, ולאחר מכן קירור לטמפרטורת החדר למשך 30 דקות. הקטעים הודגרו בתמיסת חיץ כביסה Agilent (מספר קטלוג K800721-2) למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
תיוג חיסוני פלואורסצנטי
דגימות הודגרו עם נוגדנים ראשוניים בריכוזים בהתאם להנחיות הספק בתמיסת דילול נוגדנים Agilent (מספר קטלוג K800621-2) למשך הלילה ב-4°C, ולאחר מכן כביסה שלוש פעמים למשך 5 דקות עם תמיסת חיץ כביסה של Agilent. לאחר מכן, קטעים הודגרו עם נוגדנים משניים מתאימים כמו גם נוגדנים ראשוניים מצומדים ישירות בריכוזים לפי הנחיות הספק עם DAPI (Sigma-Aldrich D9542) בריכוז סופי של 1 μg ml-1 בתמיסת דילול נוגדנים של Agilent למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר ושטפה שוב שלוש פעמים למשך 1 דקות עם תמיסת חיץ כביסה של Agilent. צביעת פאן-חלבון בוצעה באמצעות NHS-ester (סוצ'ינימידיל אסטר) מצומד עם Alexa Fluor 5 (Invitrogen A20009) בהתאם להנחיות הספק. נעשה שימוש בנוגדנים המשניים הבאים: עז נגד שפן ניסיונות Alexa Fluor 488 (Invitrogen A11073), עז נגד שפן ניסיונות Alexa Fluor 555 (Invitrogen A21435), עז נגד עכבר IgG1 Alexa Fluor 488 (Invitrogen A21121), עז נגד ארנבת Atto 647N (Sigma-Aldrich MFCD06798562), עז נגד עכברושים Alexa Fluor 555 (Invitrogen A21434) ו-streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate (Invitrogen S21381). לאחר צביעה חיסונית, הדגימות הותקנו עם ProLong Gold (Invitrogen P36930) להדמיה לפני הרחבה.
הכלאה פלורסנטית במקום
הכלאה פלורסנטית במקום בוצעה בדגימות כליות עכברים FFPE באמצעות RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit V2 Assay (קטלוג מס' 323100) לפי הנחיות היצרן וכפי שתואר קודם לכן42. בדיקת RNAscope NPHS-1 מבית Advanced Cell Diagnostics (קטלוג מס' 43357) שימשה לזיהוי NPHS-1 mRNA וצבע Opal 570 מבית Akoya Biosciences (קטלוג מס' OP-001003; דילול, 1:1,500) יושם לפיתוח אותות.
הסרת כיסוי כיסוי
קטעים שסומנו בעבר חימוניים שהותקנו והצטלמו נטבלו לזמן קצר בקסילן למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן הכיסוי הוסר בזהירות באמצעות סכין גילוח. מדיית ההרכבה נשטפה עם PBS למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
נוגדנים ראשוניים
הנוגדנים העיקריים והמינים והדילולים שלהם בהתאמה המשמשים במחקר זה הם כדלקמן: AIF1 (Cell Signaling Technology 5318; rabbit, 1:200), aSMA/FITC conjugate (Abcam F3777; mouse, 1:200), calreticulin (Abcam ab92516; rabbit, 1:200), CD42b (Abcam ab227669; rabbit, 1:200), קולגן IV (Abcam ab6586; rabbit, 1:200), ציטוקרטין 8 (R&D Systems MAB3165; עכבר IgG1, endomacin (S), 1:200 Cruz Biotechnology sc-65495; עכברוש IgG2a, 1:200), GFAP (Thermo Fisher Scientific 14-9892-82; עכבר IgG1, 1:200), MIB1 (Abcam ab124929; rabbit, 1:200), nephrin N2; שפן ניסיונות, 1:100), סינפטופודין (Synaptic Systems 163 004; שפן ניסיונות, 1:100), β-עמילואיד (Thermo Fisher Scientific 715800; ארנב, 1:200), וימנטין (Guine GP53,; :1), vWF (Agilent A200-008229; rabbit, 2:1), laminin (Abcam ab200; rabbit, 11575:1) ו-CD200 VE-CAD (Thermo Fisher Scientific 144-14-1441:82, rat,) .
הרחבת רקמות
פרוטוקולים להרחבת רקמות לרזולוציה אופטית משופרת בחתכים דקים תוארו בעבר6. בקצרה, קטעים עם סימון חיסוני ופלורסצנטי הכלאה באתר עברו טיפול עיגון עם 0.1 mg ml-1 Acryloyl-X, 6-((acryloyl)amino) hexanoic acid, succinimidylester (Invitrogen A20770). מצד שני, לא נדרש טיפול עיגון נוסף עבור מקטעים הכלאיים של פלואורסצנציה במקום, שכן RNAscope Multiplex Fluorescent Reagent Kit V2 Assay משתמש בטכנולוגיית הגברת אותות Tyramide הקניינית של Akoya Biosciences, וכתוצאה מכך שיקוע קוולנטי של מולקולות צבע OPAL לחלבונים קרובים. מנות Acryloyl-X הומסו ב-DMSO נטול מים בריכוז של 10.0 mg ml-1 לאחסון לטווח ארוך ב-20°C ומדולל ב-PBS לריכוז סופי של 0.1 mg ml-1 בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות. לאחר מכן הוטבעו קטעי רקמה לתוך תמיסה ג'ל המורכבת מ-1× PBS, 2 M NaCl, 8.625% נתרן אקרילט (Sigma-Aldrich 408220), 2.500% אקרילאמיד (Sigma-Aldrich A3553), 0.100% N-N′-methylenbis-(acrylamide) (Sigma-Aldrich 146072), 0.010% 4-hydroxy-2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-1-oxyl (Sigma-Aldrich 176141), 0.200% N,N,N′,N′-tetramethylethylenediamine (Sigma-Aldrich T9281) ו-0.200% אמוניום פרסולפט (PanReac AppliChem, A1142). מקטעים משובצים בתמיסת הג'ל הודגרו ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות כדי לאפשר את חדירת תמיסת הג'ל לרקמה. לאחר מכן נבנו סביב הרקמה תאי ג'לינג, שכל אחד מהם מורכב משני כיסויי כיסוי כמרווחים משני צידי הרקמה למניעת דחיסה וכיסוי שלישי על גבי הרקמה. בנוסף, קטעים הודגרו בתנור לחות ב-37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות כדי להשלים את הג'ל. לאחר מכן, תאי הג'ל הוסרו, ודגימות הודגרו ב-8 U ml-1 proteinase K (Sigma-Aldrich P2308) במאגר עיכול מבוסס Tris/EDTA (50 mM Tris (pH 8), 25 mM EDTA, 0.5% Triton X-100 ו-0.8 M NaCl) ב-60 °C למשך 4°C. לאחר העיכול, קטעי רקמה משובצים בג'ל הונחו במים כפולים מפושטים בטמפרטורת החדר למשך 60 דקות כדי לאפשר התפשטות איזוטרופית. לאחר השלמת ההתרחבות, הרקמות הוסרו מהמים הכפולים ב-deionized והורכבו בשקופיות תא תחתית זכוכית (Ibidi µ-Slide תחתית זכוכית שתי בארות; קטלוג מס' 80287) להדמיה לאחר מכן.
הרכבה והרחבה של Nanoruler
ננו-סרלים תואמים ל-ExM, מצוידים בקבוצות אקרידיטים כדי לאפשר קישור קוולנטי למטריצת הפולימר במהלך ג'לציה ועוגני ביוטין כדי לאפשר אימוביליזציה על משטח בקר בסרום אלבומין (BSA) – ביוטין/Neutravidin, הוזמנו בהתאמה אישית מ-GATTAquant DNA Nanotechnologies. ראשית, כדי לאפשר אימוביליזציה של ננו-סרלים, שקופיות זכוכית צפו ב-BSA-biotin/Neutravidin. ליתר דיוק, שקופיות הזכוכית נשטפו תחילה שלוש פעמים עם 1,000 μl PBS, ולאחר מכן הודגרו עם 200 μl Pierce BSA, ביוטיניל (Thermo Scientific 29130) בריכוז של 1 mg ml.-1, מומס ב-PBS, ואחריו כביסה שלוש פעמים נוספות עם 1,000 μl PBS. לאחר מכן הודגרה הרקמות עם 200 μl תמיסה של NeutrAvidin (1 mg ml-1 NeutrAvidin חלבון (Thermo Scientific 31000) מומס ב-PBS) למשך 5 דקות. תמיסת NeutrAvidin נשטפה על ידי מריחת שלוש פעמים 1,000 μl PBS, בתוספת 10 mM מגנזיום כלוריד. תמיסות מלאי ננורולר תואמות ExM הודללו ביחס של 1:10 ב-PBS, נוספו עם 10'mM מגנזיום כלוריד ולאחר מכן הוחלו על שקופיות זכוכית מצופה BSA-biotin/NeutrAvidin, הודגרה למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן שלוש שטיפות. שלבים עם 1,000 μl PBS בתוספת 10 mM מגנזיום כלוריד. השקופיות הותקנו ב-PBS בתוספת 10'mM מגנזיום כלוריד להדמיה מוקדמת של הרחבה.
לאחר רכישת תמונה לפני הרחבה, כיסויי כיסוי הוסרו. באנלוגיה לפרוטוקול הרחבת הרקמה שתואר לעיל, הננו-סרלים הוטמעו בתמיסת הג'ל של ExM והודגרו ב-4 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ולאחר מכן בניית תאי הג'ל, ולאחר מכן בוצע שלב הג'ל על ידי דגירה בתנור לח. ב-37 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות. לאחר השלמת הג'לציה, תאי הג'ל הוסרו וכשלב עיכול, הננו-סרלים עברו דנטורציה כדי לאפשר הרחבה לאחר מכן על ידי דגירה בתמיסת פורמאמיד 50% (Sigma-Aldrich F9037) למשך שעתיים בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן דגירה ב-2°° C למשך 4 שעות. לאחר מכן הונחו הננו-סרולים הדנטורטיים במים כפולים דה-יונים בטמפרטורת החדר למשך 12 דקות כדי לאפשר התפשטות איזוטרופית. לאחר ההרחבה, הדגימות הוסרו מהמים הכפולים שהוננו והורכבו בשקופיות תא עם תחתית זכוכית (Ibidi µ-Slide תחתית זכוכית שתי בארות; קטלוג מס' 60) להדמיה לאחר הרחבה.
הדמיה של ננו-סרולים
הדמיית WF מבוססת LED לפני ואחרי ההרחבה של ננו-סרלים בוצעה באמצעות THUNDER Imager 3D Live Cell ו-3D Cell Culture (Leica Microsystems) מצויד באובייקטיבי ×100 (צמצם מספרי (NA), 1.47). עוצמת ה-LED וזמני החשיפה עבור כל מצב הותאמו באופן שיטתי. כדי לאפשר עיבוד SRRF שלפני ואחרי ההרחבה, התקבלו תמונות מוערמות בזמן (כאשר כל ערימת זמן מורכבת מ-50 תמונות). הדמיה קונפוקלית לפני ואחרי ההרחבה של הננו-סרגלים בוצעה באמצעות המיקרוסקופ הקונפוקאלי Zeiss LSM 800 עם AiryScan תוך שימוש ביעד האופטימלי ×63 (NA, 1.4) בזום דיגיטלי פי 12 עם עיבוד AiryScan לאחר מכן באמצעות ZEN2.6 (כחול) מהדורה) תוכנה.
הערכה של הפרדת PSF ננו-רוסית
כדי להעריך את ההפרדה של ה-PSF הננו-שורל לאחר רכישת תמונה, קבצי הדמיה מוערמים בזמן מכל הקבוצות (120-25 ננומטר, לפני ואחרי הרחבה) הועברו תחילה בדוי-שם לצורך ניתוח כמותי חסר פניות נוסף על ידי צופה בלתי תלוי ללא מעורבות במדגם הכנה ורכישת תמונה. מתוך ערימות זמן אלו, 16-20 אזורים המכסים ננו-סרגל אחד נבחרו באקראי לקבוצה על סמך נתוני ההדמיה הגולמיים, ולאחר מכן בוצע עיבוד SRRF. הן תמונות גולמיות והן מעובדות SRRF עברו לאחר מכן התאמות היסטוגרמה מפוקחת לקביעת הפרדת PSF ננו-רוסית, שהוגדרה כשתי מקסימום ניאון שהופרדו בבירור על ידי לפחות פיקסל אחד ללא כל אות.
הערכת מקדם התרחבות ודיווח
כדי להעריך את גורם ההתרחבות, נמדדו מרחקים בין שני הבדיקות הפלורסנטיות של הננו-סרולים באמצעות כלי פרופיל העלילה ImageJ2 Version 2.3.0/1.53q. קו הממוקם במרכז דרך שני הפלואורופורים צויר והפרופיל של עוצמת הפיקסלים לאורך הקו הזה נוצר. לאחר מכן, חושב המרחק בין שני מקסימום העצימות, המתארים את מרכזי הפלואורופורים. כמו בדיווח הקודם6 כמו גם אימות יסודי של גורם ההתרחבות בקנה מידה ננו (באמצעות ננו-סרגלים), עבור כל התמונות ExSRRF, התקבלו תמונות קורלטיביות לפני ואחרי התרחבות של אזור העניין (ROI) כדי להתייחס למרחקים שלאחר ההתרחבות למרחקים שלפני ההרחבה. -הרחבת מרחקים ביולוגיים, המאשרת את יציבות גורם ההתפשטות בקנה מידה מיקרומטר.
הדמיה של רקמות לפני ואחרי הרחבה
הדמיית WF מבוססת LED של רקמות לפני ואחרי הרחבה בוצעה באמצעות THUNDER Imager 3D Live Cell ו-3D Cell Culture (Leica Microsystems). סקירה כללית של הרקמה השלמה בהגדלה נמוכה לפני ואחרי התרחבות בוצעו עם יעד ×20 (NA, 0.40). תמונות בהגדלה גבוהה לפני ואחרי הרחבה התקבלו באמצעות מטרות מרובות, כולל מטרה ×40 (NA, 1.10), מטרה ×63 (NA, 1.10) ואובייקטיבית ×100 (NA, 1.47) לאחר אופטימיזציה של עוצמת LED ו זמני חשיפה. כדי לאפשר עיבוד SRRF לאחר ההרחבה, ערימות זמן (כל אחת מורכבת בין 20 ל-200 תמונות בהתאם לדרישות הניסוי) הושגו עבור כל החזר ROI.
רישום תמונת ערימת זמן ותיקון תנועה
כדי לתקן תנועה פוטנציאלית במהלך ההדמיה, תמונות בתוך כל מחסנית זמן נרשמו לראשונה ב-Python 3 באמצעות scikit-image43 (https://scikit-image.org/) וספריות רישום תמונות (https://image-registration.readthedocs.io/en/latest/). כל תמונה בערימה מיושרת בנפרד לתמונה הראשונה בערימת הזמן באמצעות ערוץ התייחסות המכיל את המבנה העיקרי של העניין שלנו. בכל תמונה של ערוץ ההתייחסות, המבנים הוחלקו תחילה באמצעות מסנן גאוסי עם סטיית תקן של 1. לאחר מכן, האחוזון התחתון של 90 של ערכי הפיקסלים נקבע ל-0, תוך שמירה על האחוזון העליון של 10 של ערכי הפיקסלים. לאחר מכן, ההיסטוגרמה של כל תמונה בערימת הזמן הותאמה כך שתתאים להיסטוגרמה הייחוס. לבסוף, המעבר בין שתי התמונות התקבל עם הפונקציה chi2 העברה מספריית רישום התמונות, המשתמשת בשיטת העלאת דגימת הטרנספורמציה הדיסקרטית של פורייה. המעבר הזה הוסר לבסוף מכל ערוצי התמונה, שנחתכו ורופדו כדי לשמור על הגודל המקורי ולאחר מכן הוקמו מחדש לערימת תמונה.
SRRF ו-NanoJ-SQUIRREL
עיבוד SRRF של נתונים גולמיים בוצע באמצעות תוכנת ההדמיה של פיג'י גרסה 2.3.0/1.53q (Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics) בשילוב עם תוסף NanoJ-SRRF.
עבור עיבוד SRRF לפני ואחרי ההרחבה, קבצים מוערמים בזמן גולמי עובדו באמצעות הגדרות ה-SRRF הבאות. רדיוס הטבעת, 0.5; הגדלת רדיאליות, 10; צירים בטבעת; 8; ניתוח זמני; רדיאליות זמנית, רדיאליות ממוצעת; להסיר אילוץ חיוביות 'נכה'; לנרמל מחדש את 'נכים'; לעשות החלקת שיפוע 'מושבת'; שקלול, לעשות שקלול אינטנסיביות 'פעיל'; לעשות שקלול גרדיאנט 'נכה'; תיקונים, למזער דפוסי SRRF 'פעילים'; ליניאריזציה מהירה של SRRF 'מושבת'.
עבור כל שאר התמונות המבוססות על רקמות, קבצים מוערמים בזמן או קבצים מותאמים להיסטוגרמה עובדו באמצעות ההגדרות הבאות. רדיוס הטבעת, 0.5-2.0; הגדלת רדיאליות, 3-10 (בהתאם להגדלה הרצויה); צירים בטבעת, 2–8 (בהתאם להגדלה הרצויה); ניתוח זמני; רדיאליות זמנית, רדיאליות ממוצעת; להסיר אילוץ חיוביות 'נכה'; לנרמל מחדש 'נכים'; לעשות החלקת גרדיאנט 'אקטיבית'; שקלול, לעשות שקלול אינטנסיביות 'פעיל'; לעשות שקלול גרדיאנט 'נכה'; תיקונים, למזער דפוסי SRRF 'פעילים'; ליניאריזציה מהירה של SRRF 'מושבת'. לעיבוד של ערוץ NHS-ester הפוך (איור. 1b), האות NHS-ester התהפך לראשונה באמצעות הפונקציה 'היפוך' בפיג'י, ולאחר מכן בוצע עיבוד SRRF (כמתואר לעיל). להערכת שיפור האיכות על ידי תהליך רישום התמונה, נעשה שימוש באלגוריתם דירוג תמונה כמותי ברזולוציית העל ודיווח על מיקומי שגיאה (SQUIRREL). החזר ROI תואם נבחרו במערכי נתונים גולמיים ורשומים כאחד. לאחר עיבוד עם אלגוריתם SRRF, התמונות ברזולוציית העל שהתקבלו הושוו לתמונה הראשונה של כל מחסנית קשורה באמצעות אלגוריתם SQUIRREL. מפות השגיאות שנוצרו שימשו כדי להדגיש חזותית אזורים בעלי אי התאמה גבוהה, בעוד שמקדמי פירסון בקנה מידה של רזולוציה שימשו להשוואה כמותית בין מערכי נתונים גולמיים לרשומים.
התאמת כיוון התמונה להכנת הדמות
תמונות טרום הרחבה ואחרות הרחבה (תמונות גולמיות ועיבוד SRRF) סובבו באמצעות פיג'י כדי לקבל כיוון דומה של המבנים ב- X ו Y צירים. גישה זו לא יצרה חפצים חזותיים, אם כי לא ניתן לשלול בכל המקרים חפצי סיבוב בדידים בקצוות התמונה באזורים ללא האות האמיתי.
כימות של רוחב FP ו-SD
כדי למדוד את רוחב ה-SD בביופסיות של כליות אנושיות שנצבעו בנפרין, התמונות של ExSRRF עברו לראשונה סף אוטומטי באמצעות כלי הסף ImageJ בשילוב עם אלגוריתם ברירת המחדל ומותאמים אוטומטית. לאחר מכן נמדד רוחב ה-SD באמצעות כלי פרופיל העלילה ImageJ. קו הממוקם בזווית של 90 מעלות דרך ה-SD עם הסף צויר במספר מיקומים אקראיים לאורך ה-SD ואחריו ניתוח פרופיל עלילה של רוחב האות. כדי למדוד את רוחב ה-FP בביופסיות של כליות אנושיות, תמונות ExSRRF מדגימות ביופסיה של כליות אנושיות מוכתמות בנפרין עברו תחילה עיבוד שלבים המבוסס על ImageJ לצורך זיהוי מורפולוגי עקיף ופילוח של FPs. ראשית, בוצע סף באמצעות אלגוריתם ברירת המחדל במצב ההתאמה האוטומטית, ואחריו היפוך תמונה, ופילוח פרשת מים, שעל בסיסם בוצע פילוח מפוקח נוסף וכתוצאה מכך זיהוי FPs המופרדים על ידי SD. רוחב ה-FP נמדד לאחר מכן באמצעות כלי פרופיל העלילה ImageJ על ידי ציור קו בזווית של 90 מעלות דרך ה-FP במספר מיקומים אקראיים ואחריו ניתוח פרופיל עלילה של רוחב האות.
כימות אוטומטי של צפיפות SD והרחבה
כדי לכמת את צפיפות ה-SD, פותח תהליך רב-שלבי ב-Python 3 באמצעות ספריית התמונות scikit-image43. ראשית, ה-ROI חולץ, כאשר מבני העניין נמצאים. לאחר מכן, המבנים המעניינים חולצו באמצעות זיהוי רכס ועיבוד לאחר. לבסוף, הצפיפות של מבנים אלה חושבה בתוך ה-ROI שחולץ. השלבים והפרמטרים בתהליך זה עברו אופטימיזציה על שתי תמונות מדגימות IgAN ותמונה אחת מדגימות ה-MCD ורק לאחר מכן הורחבו לכל שאר התמונות. התוצאות הוערכו תחילה חזותית לפני בדיקת הצפיפות הכמותית.
כדי לחלץ את החזר ה-ROI, התמונה הופחתה תחילה ל-25% מהגודל המקורי שלה. לאחר מכן, התמונה הוגדרה בסף להסרת רעש ברמה נמוכה והחלקה באמצעות מסנן גאוסי עם סטיית תקן של 8, ולאחר מכן סף Otsu. לאחר מכן יושמה מורפולוגיה מתמטית (מילוי בינארי של חורים וסגירה בינארית). לבסוף, כל האזורים המחוברים חולצו ורק אלה שגדולים מסף מסוים (5,000 פיקסלים) נשמרו. החזר ה-ROI שהתקבל הועלה שוב לגודל התמונה המקורי.
פילוח SD בוצע בעזרת זיהוי רכס באמצעות גלאי הרכס של Meijering44. הרכסים שהתקבלו הוגבלו כך שיישמרו רק ערכים גדולים מ-0.2 והוחלה מורפולוגיה מתמטית (פתיחה). צפיפות SD התקבלו לבסוף כיחס הפיקסלים המשויכים ל-SD בתוך ה-ROI. בנוסף, הרחבת SD חושבה באופן דומה לעובי ומרווח טרבקולרי45, תוסף נפוץ לניתוח צפיפות עצם. מרווח מקומי בפיקסל של התמונה הוא קוטר המעגל הגדול ביותר שמתאים בתוך המרווח בין רכסים, ואשר מהווה חלק מה-ROI ומכיל את הנקודה. מאקרו ImageJ המיושם חישב את הממוצע, החציון, סטיית התקן ושבריר השטח של מרווח הרכס. עבור מחקר זה, השתמשנו בחציון לתמונה.
כימות אוטומטי של מתח ER
כדי לכמת את הנזק שנגרם על ידי IRI, פותח ב-Python 3 תהליך רב-שלבי הדומה לחישוב של צפיפות SD והתרחבות באמצעות ספריית התמונות scikit-image43. ראשית, ה-ROI חולץ, כאשר מבני העניין נמצאים. לאחר מכן, המבנים המעניינים חולצו באמצעות זיהוי רכס ועיבוד לאחר. לבסוף, הצפיפות של מבנים אלה חושבה בתוך ה-ROI שחולץ. השלבים והפרמטרים בתהליך זה הותאמו מחישוב צפיפות והרחבת SD ועברו אופטימיזציה על תמונה אחת מדגימות הבקרה ותמונה אחת מדגימות IRI ורק לאחר מכן הורחבו לכל שאר התמונות. התוצאות הוערכו תחילה חזותית לפני בדיקת הצפיפות הכמותית.
כדי לחלץ את החזר ה-ROI, התמונה הופחתה תחילה ל-25% מהגודל המקורי שלה. התמונה הוחלקה באמצעות מסנן גאוס עם סטיית תקן של 8 ומסנן גאוס עם סטיית תקן של 10, ואחריו סף Otsu. לאחר מכן יושמה מורפולוגיה מתמטית (מילוי בינארי של חורים). לבסוף, כל האזורים המחוברים חולצו ורק אלה שגדולים מסף מסוים (5,000 פיקסלים) נשמרו. החזר ה-ROI שהתקבל הועלה שוב לגודל התמונה המקורי.
פילוח של רשתות ER מבוססות קלרטיקולין בוצע בעזרת זיהוי רכס באמצעות גלאי רכס Meijering44. הרכסים שהתקבלו הוגדרו בסף לשמור רק על ערכים גדולים מ-0.25; עצמים קטנים בגודל של פחות מ-125 פיקסלים הוסרו, והוחלה מורפולוגיה מתמטית (פתיחה). צפיפות ה-ER התקבלו לבסוף כיחס הפיקסלים המשויכים ל-ER בתוך ה-ROI. בנוסף, הרחבת ER חושבה באופן דומה לעובי ומרווח טרבקולרי45, תוסף נפוץ לניתוח צפיפות עצם. מרווח מקומי בפיקסל של התמונה הוא קוטר המעגל הגדול ביותר שמתאים בתוך המרווח בין הרכסים, ואשר מהווה חלק מה-ROI ומכיל את הנקודה. מאקרו ImageJ המיושם חישב את הממוצע, החציון, סטיית התקן ושבריר השטח של מרווח הרכס.
הערכת תיקוני סחיפה
הרישומים של ערימות זמן הוערכו על ידי התחשבות בקיזוז שבו היה צריך להזיז את המסגרות במהלך תהליך הרישום. עבור כל פריים בערימת הזמן, מרחק ההיסט (2-נורמה) של x ו y ההיסטים חושבו באמצעות פונקציית האלגברה הליניארית בספריית NumPy (https://numpy.org/) באמצעות Python 3. ההיסטים האלה מבחינת הזמן סוכמו בהיסט הממוצע וההיסט האחרון, בהתייחס להיסט של המסגרת הסופית, בדרך כלל ההיסט הגדול ביותר בערימת זמן. עבור כל נקודת זמן, מדד הדמיון המבני הממוצע (MSSIM) והשגיאה הממוצעת בריבוע (MSE) חושבו באמצעות ספריית התמונות scikit-image43. מדדים אלו חושבו הן עבור פריימים מקוריים והן עבור פריימים רשומים ביחס למסגרת הראשונה (מסגרת ייחוס עבור הרישומים), רק תוך התחשבות באזורים החופפים של התמונה כדי לאפשר השוואה. הם סוכמו ב-MSSIM הממוצע והאחרון, וה-MSEs הממוצע והאחרון לפני ואחרי הרישום לכל מחסנית זמן. הערכים לאחר הרישום הופחתו מאלה שלפני הרישום כדי למדוד את השפעת הרישום. ה-MSSIM גדול יותר עבור מבנים דומים יותר, מה שאומר ששינוי שלילי מצביע על שיפור באמצעות רישום, בעוד שה-MSE קטן יותר עבור תמונות דומות יותר; לפיכך, שינוי חיובי מעיד על שיפור.
סטיית תקן (s.d.) בהיסט (מבוססת על 0.5 × s.d. מהממוצע) שימשה כגורם הקובע לפיצול ערימות הזמן לשתי קבוצות: סחיפה נמוכה (הרוב המכריע) ואלה עם יותר רישום הדרוש עם היסט. גדול מ-0.5 × s.d. הוגדרו כסחיפה גבוהה. לאחר מכן הושוו שתי הקבוצות במונחים של השיפור שהושג במהלך הרישום. כל הקודים יושמו בפייתון 3.
הערכת כימות רזולוציה לפילוח אמין
כדי להעריך את החדות וההתאמה של התמונות לשימוש לניתוח נוסף של המבנים, הושוו תמונות ה-ExM, ExSRRF וה-STED הגולמיות עם הרכסים הראשוניים שזוהו בכל תמונה באמצעות מדד הדמיון המבני. מדד דמיון מבני קרוב יותר ל-1 הצביע על דמיון מבני טוב יותר בין התמונות לרכסים, ובכך הצביע על כך שיש התאמה טובה יותר בין הרכסים המחושבים והמבנים מהתמונות הגולמיות.
מיקרוסקופ אלקטרונים העברה
רקמות כליה של עכברים קובעו לזמן קצר עם 4.0% PFA ו-2.5% גלוטאראלדהיד במאגר 0.1 M קקודילט (pH 7.4) באתר בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן נותחו, הוסרו וחתכו לחתיכות של 1 מ"מ.3 וקבוע למשך 48 שעות באותה תמיסה ב-4 מעלות צלזיוס. גושי הרקמות היו מנוגדים באמצעות 1% OsO4 (Roth 7436.1) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת ו-1% אורניל אצטט (Polysciences 1-21447) ב-25% אתנול בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר התייבשות, גושי רקמה הוטמעו בשרף אפוקסי (Durcopan ACM, Sigma-Aldrich 70), וחתכים אולטרה-דקים בעובי 1 ננומטר נחתכו באמצעות Leica EM UC44611 ultramicrotome (Leica Microsystems). החתכים צולמו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני תמסורת Zeiss 50 ונותחו באמצעות תוכנת ITEM גרסה 6 (מבנה 910).
ביופסיות של כליות אנושיות נותחו על פי נהלי הפעלה סטנדרטיים במהלך אבחון האבחון והועברו מ-4% פורמלדהיד למאגר קקודילט יחד עם סוכרוז למשך 10 דקות ב-80 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, OsO4 הוחל למשך 2 שעות, ולאחר מכן כביסה במאגר קקודילט בתוספת סוכרוז פעמיים למשך 5 דקות. לאחר מכן, הדגימה הייתה בניגוד לאוראניל אצטט למשך שעה אחת. לאחר מכן הוכנסה הדגימה לאמבטיות אתנול עם עלייה בריכוזי אתנול למשך 1 דקות כל אחת, ואחריה מתיל-טרט-בוטיל-אתר פעמיים למשך 5 דקות כל אחת, מתיל-טרט-בוטילתר פלוס תערובת אפוקסיד (בדילול 1:3). לאחר מכן, הדגימות הוטבעו בתערובת אפוקסיד ב-60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות ולאחר מכן ב-100 מעלות צלזיוס למשך 11.5 שעות. חתכים חצי דקים ואולטרה-דקים נחתכו על מיקרוטום Reichert Jung Ultracut E701704. רשתות נרכשו מפוליסיינס. לאחר מכן נותחו הרשתות באמצעות מכשירי EM (EM 109 ו-EM 902, Zeiss) מצוידים במצלמות EM דיגיטליות (Tröndle). נותח גלומרולוס אחד מכל מקרה.
מיקרוסקופ STED
תיוג פלורסנטי של דגימות STED בוצע כמתואר לעיל. התמונות צולמו עם מיקרוסקופ Abberior Instruments FACILITY LINE מצויד במיקרוסקופ הפוך IX83 (Olympus), מטרת שמן ×60 (שמן UPlanXApo ×60/1.42, אולימפוס), תוך שימוש בלייזרי עירור פולסים ב-488, 561 ו-640 ננומטר ו- לייזר STED דופק הפועל ב-775 ננומטר, כמו גם מכשיר Abberior Expert Line בעל ארבעה ערוצים easy3D STED המצויד בקרן דלדול של 775 ננומטר (Abberior Instruments), מטרת שמן ×60 (Nikon ×60/1.4) וסורק QUAD beam באמצעות אלומת דיודה פועמת של 640 ננומטר, מדולדלת עם אלומת STED של 775 ננומטר ומזוהה באמצעות פוטודיודת מפולת עם מסנן מעבר פס קדמי של 685 ± 70 16.3.16118. כל פעולות הרכישה נשלטו על ידי תוכנת Lightbox גרסה XNUMX. לבסוף, נעשה שימוש בטכניקת ה-deconvolution (Richardson-Lucy) כדי לשפר את איכות התמונה.
תא הדמיה בהדפסת תלת מימד
כיסויים של NEXTERION (גודל, 110.000 × 74.000 ± 0.200 mm; עובי, 0.175 ± 0.020 mm; SCHOTT) שימשו להרכבה של רקמות מורחבות ל-µ -bottom בזכוכית גדולה מדי. פתרון הרכבה שנבנה בהתאמה אישית, כולל מסגרת, כרית אלסטית ומכסה למסגרת הודפסו באמצעות מדפסת תלת מימד לשאת את כיסויי הכיסוי של NEXTERION כדי לאפשר הרכבה ב-THUNDER Imager 3D Live Cell ו-3D Cell Culture (Leica Microsystems).
המסגרת נושאת את הכיסוי NEXTERION המאפשר החדרה ל-THUNDER Imager 3D Live Cell ו-3D Cell Culture (Leica Microsystems). הכרית האלסטית ממוקמת בין הכיסוי למכסה NEXTERION, ומונעת מזכוכית הכיסוי להישבר כאשר היא ננעלת במקומה על ידי המכסה. המכסה למסגרת מייצב את הכיסוי של NEXTERION למסגרת. כיסוי הכיסוי והכרית של NEXTERION ננעלים במלואן למסגרת על ידי הגדרת הטריזים האלה לחריצים במסגרת. Tinkercad (Autodesk; https://www.tinkercad.com) נוצל ליצירת עיצובים עבור כל החלקים המודפסים בתלת מימד.
כל החלקים ומאפייני העיצוב המודפסים בתלת-ממד מוצגים באיורי נתונים מורחבים. 2 ו 3. המסגרת והמכסה הודפסו באמצעות חוט PolyLite PLA 1.75 mm (Polymaker). הכרית הודפסה באמצעות נימה NinjaFlex TPU 1.75 mm (NinjaTek). אנדר-5 פלוס (Creality) שימש להדפסת תלת מימד. ההגדרות בהן נעשה שימוש ב- Ultimaker Cura (v. 3; Ultimaker) הן כדלקמן. גודל זרבובית, 4.13.1 mm; גובה שכבה, 0.40 mm (PLA) ו-0.16 mm (TPU); עובי דופן, 0.20 מ"מ (PLA) ו-1.20 מ"מ (TPU); עובי עליון/תחתון, 0.80 מ"מ (PLA) ו-1.20 מ"מ (TPU); טמפרטורת הזרבובית, 0.80 °C (PLA) ו-220 °C (TPU); טמפרטורת המיטה, 235°C; מהירות מאוורר, 50%; מהירות הדפסה, 100 מ"מ שניות-1 (PLA) ו-20 מ"מ שניות-1 (TPU); מהירות הדפסה בשכבה ראשונה, 25 מ"מ שניות-1 (PLA) ו-10 מ"מ שניות-1 (TPU); אינפיל, 10% וזיגזג; הדבקה של לוחית בנייה, אין. סרטי מסקינג שימשו ליצירת משטח דבק על המיטה.
ניתוח סטטיסטי
כל הניתוחים הסטטיסטיים בוצעו באמצעות GraphPad Prism (גרסה 9.3.1). עלילות כינור מדווחות על הטווח החציוני והבין-רבעוני. המובהקות הוערכה באמצעות הבלתי מזווג t-בדיקות עם התיקון של Welch בהשוואה בין שני משתנים רציפים; זוג t-בדיקת הגדרות לפני/אחרי; והמבחנים של Brown–Forsythe, Welch ANOVA ודנט בעת השוואה בין שלושה משתנים רציפים. עקומות אופייניות להפעלת המקלט נוצרו בשיטת וילסון/בראון (95% רווח סמך; התוצאות מבוטאות באחוזים). א p ערך מתחת ל-0.05 נחשב למובהק סטטיסטית.
- הפצת תוכן ויחסי ציבור מופעל על ידי SEO. קבל הגברה היום.
- Platoblockchain. Web3 Metaverse Intelligence. ידע מוגבר. גישה כאן.
- מקור: https://www.nature.com/articles/s41565-023-01328-z
- :הוא
- ][עמ'
- $ למעלה
- 000
- 1
- 1.3
- 10
- 100
- 11
- 110
- 2%
- 2012
- 2014
- 2017
- 39
- 3d
- הדפסת 3D
- 7
- 70
- 8
- 9
- 95%
- a
- מֵעַל
- גישה
- פי
- חֶשְׁבּוֹן
- הושג
- ACM
- רכישה
- Ad
- מותאם
- הוסיף
- תוספת
- מותאם
- התאמות
- מתקדם
- לאחר
- AL
- Alexa
- אַלגוֹרִיתְם
- מיושר
- תעשיות
- מאפשר
- למרות
- הגברה
- אנליזה
- עוגן
- ו
- בעלי חיים
- בעלי חיים
- אחר
- נוגדנים
- בקשה
- יישומית
- מריחה
- גישה
- מתאים
- הסכמה
- מאושר
- ARE
- AREA
- אזורים
- סביב
- AS
- הערכה
- המשויך
- At
- Autodesk
- אוטומטי
- מפולת שלגים
- מְמוּצָע
- AXES
- בחזרה
- מבוסס
- BE
- קרן
- לפני
- להיות
- להלן
- מוטב
- בֵּין
- כריכה
- ביולוגיה
- ביוטכנולוגיה
- להב
- אבני
- כָּחוֹל
- לוּחַ
- עֶצֶם
- תַחתִית
- שבירה
- בקצרה
- ארגון ה-BSA
- חיץ
- לִבנוֹת
- by
- מחושב
- מצלמות
- מחלת הסרטן
- לא יכול
- בזהירות
- לשאת
- מקרה
- מקרים
- גרם
- מרכז
- מסוים
- תָא
- שינוי
- ערוץ
- ערוצים
- מאפיין
- בדיקה
- מעגל
- מַהְדֵק
- קלאסי
- בבירור
- קליק
- קליני
- סגור
- קרוב יותר
- סגירה
- קופונים
- שיתוף פעולה
- אוספים
- COM
- שילוב
- הוועדה
- בדרך כלל
- COMP
- לעומת
- השוואה
- השוואה
- להשלים
- מַשׁלִים
- ריכוז
- מצב
- תנאים
- אמון
- מחובר
- נחשב
- מורכב
- בניה
- מכיל
- רציף
- לִשְׁלוֹט
- נשלט
- בקרות
- תיקונים
- תוֹאֵם
- קובלנטי
- לכסות
- כיסוי
- לִיצוֹר
- תַרְבּוּת
- מנהג
- שהותקן
- חותך
- DA
- יומי
- נתונים
- מערכי נתונים
- ימים
- בְּרִירַת מֶחדָל
- מוגדר
- צפיפות
- מַחלָקָה
- תלוי
- מתאר
- מְתוּאָר
- עיצוב
- עיצובים
- זוהה
- איתור
- לקבוע
- קביעה
- מפותח
- צעצועי התפתחות
- התפתחותי
- סטייה
- DID
- דיגיטלי
- דילול
- ישירות
- אי התאמה
- מרחק
- חטיבה
- ה-DNA
- מטה
- ציור
- נמשך
- טיפות
- בְּמַהֲלָך
- e
- כל אחד
- מהדורה
- או
- מוטבע
- לאפשר
- נקודת קצה
- משופר
- מְצוּיָד
- שגיאה
- Ether (ETH)
- אֶתִי
- אתיקה
- להעריך
- העריך
- נשלל
- מורחב
- הרחבה
- לְנַסוֹת
- מומחה
- חשוף
- חשיפה
- ביטא
- תמצית
- מתקן
- אוהד
- אופנה
- מהר
- תכונות
- הפד
- תאנה
- תרשים
- קבצים
- ממולא
- לסנן
- סופי
- בסופו של דבר
- סוף
- ראשון
- מתאים
- קבוע
- תנודות
- בעקבות
- הבא
- כדלקמן
- מזון
- בעד
- פורמלדהיד
- fps
- שבריר
- מסגרת
- חופשי
- החל מ-
- חזית
- לגמרי
- פונקציה
- נוסף
- ליצור
- נוצר
- דור
- גנטיקה
- זכוכית
- זהב
- הגדול ביותר
- קְבוּצָה
- קבוצה
- הנחיות
- יד
- יש
- גובה
- לעזור
- גָבוֹהַ
- להבליט
- חורים
- בית חולים
- HTTPS
- בן אנוש
- הזדהות
- תמונה
- תמונות
- הדמיה
- שָׁקוּעַ
- פְּגִיעָה
- יושם
- לשפר
- השבחה
- in
- כולל
- דגירה
- דגירה
- עצמאי
- מדד
- הצביע
- מצביע על
- בנפרד
- בתחילה
- מכון
- מוסדי
- מכשיר
- מכשירים
- אינטרס
- התערבות
- הפוך
- מעורבות
- IT
- שֶׁלָה
- שמירה
- כליה
- כליות
- ערכה
- תִיוּג
- גָדוֹל
- גדול יותר
- הגדול ביותר
- לייזר
- לייזרים
- אחרון
- שכבה
- הוביל
- חֲקִיקָה
- ספריות
- סִפְרִיָה
- קו
- קשר
- לחיות
- מקומי
- מקומות
- נעול
- לטווח ארוך
- נמוך
- מאקרו
- ראשי
- תחזוקה
- הרוב
- מפות
- להתאים
- מתימטי
- מַטרִיצָה
- מקסימום
- אומר
- למדוד
- מדיה
- רפואי
- רפואה
- שיטה
- מדדים
- עכברים
- מיקרוסקופ
- מיקרוסקופיה
- לצמצם
- תַעֲרוֹבֶת
- מצב
- מודל
- MOL
- מולקולרי
- פיקוח
- יותר
- תנועה
- mRNA
- מספר
- טבע
- נחוץ
- שלילי
- הולנד
- רשתות
- חדש
- הבא
- NIH
- רעש
- נוֹרמָלִי
- רומן
- קהות
- מטרה
- יעדים
- אובייקטים
- להשיג
- מושג
- of
- לקזז
- שמן
- OLYMPUS
- on
- ONE
- נפתח
- פתיחה
- פועל
- תפעול
- אופטי
- אופטימיזציה
- מיטוב
- מְקוֹרִי
- אחר
- בין לילה
- סקירה
- נתיב
- מְזוּוָג
- פרמטרים
- חלק
- חלקים
- פתולוגיה
- חולים
- PBS
- פירסון
- אחוזים
- חתיכות
- פיקסל
- מקום
- פלטפורמה
- אפלטון
- מודיעין אפלטון
- אפלטון נתונים
- ועוד
- נקודה
- פולימר
- מיקום
- עמדות
- חיובי
- חִיוּבִיוּת
- פוטנציאל
- בדיוק
- להציג
- למנוע
- מניעה
- קודם
- קוֹדֶם
- יְסוֹדִי
- עקרונות
- קופונים להדפסה
- בדיקה
- נהלים
- תהליך
- תהליך
- פּרוֹפִיל
- פרופיל
- פרוגן
- קניינית
- חֶלְבּוֹן
- חלבונים
- פרוטוקול
- פרוטוקולים
- ובלבד
- פרסום
- נרכש
- גם
- פיתון
- איכות
- כמותי
- R & D
- ארנב
- אקראי
- רכס
- דרג
- דירוג
- יחס
- חי
- נתונים גולמיים
- באזור
- אזורים
- רשום
- הַרשָׁמָה
- רישום
- אָמִין
- להסיר
- הוסר
- לדווח
- דווח
- נדרש
- דרישות
- שרף
- החלטה
- כבוד
- אלה
- וכתוצאה מכך
- תוצאות
- לִשְׁמוֹר
- סקירה
- סקר
- טַבַּעַת
- עולה
- רנ"א
- ההחזר על ההשקעה
- חֶדֶר
- s
- מלח
- אותו
- סנטה
- סולם
- מדע
- SD
- משני
- סעיפים
- פילוח
- נבחר
- לְחוּד
- סדרה
- נַסיוֹב
- סט
- הצבה
- הגדרות
- משמרת
- הראה
- לאותת
- משמעות
- משמעותי
- דומה
- מידה
- שקופיות
- קטן
- קטן יותר
- רך
- תוכנה
- פִּתָרוֹן
- פתרונות
- מֶרחָב
- ספציפי
- מְהִירוּת
- לפצל
- מרובע
- יציבות
- לערום
- ערימות
- תֶקֶן
- מדינה
- מחלקת המדינה
- אמור
- סטטיסטי
- שלב
- צעדים
- מניות
- נעצר
- אחסון
- מאוחסן
- מִבנִי
- מִבְנֶה
- לימוד
- לאחר מכן
- כתוצאה מכך
- התאמה
- משטח
- כִּירוּרגִיָה
- מערכות
- נטילת
- יעד
- טכנולוגיה
- מונחים
- בדיקות
- זֶה
- השמיים
- הולנד
- שֶׁלָהֶם
- אותם
- אלה
- שְׁלִישִׁי
- שְׁלוֹשָׁה
- תלת-ממדי
- סף
- דרך
- זמן
- פִּי
- רקמות
- ל
- יַחַד
- גַם
- כלי
- כלים
- חלק עליון
- מעקב
- הועבר
- לשנות
- טיפול
- טריטון
- נָכוֹן
- פעמים
- תחת
- אוניברסיטה
- בְּדֶרֶך כְּלַל
- מנוצל
- מנצל
- אימות
- ערך
- ערכים
- משתנים
- Vast
- גרסה
- באמצעות
- קיר
- מים
- שבועות
- מִשׁקָל
- סעד
- טוֹב
- אשר
- עם
- בתוך
- לְלֹא
- תיק עבודות
- זפירנט
- זאו
- זום