Un nou instrument de editare a genelor rivalizează cu CRISPR și poate face milioane de modificări simultan

Odată cu ascensiunea fulgerătoare a CRISPR ca o minune de editare a genelor, este ușor să uiți originile sale modeste: a fost descoperit pentru prima dată ca o ciudată a sistemului imunitar bacterian.

Se pare că bacteriile au mai multe de oferit. Luna aceasta, o echipă condusă de renumitul biolog sintetic Dr. George Church de la Universitatea Harvard a deturnat o altă bucată ciudată din biologia bacteriilor. Rezultatul este un instrument puternic care poate – teoretic – edita simultan milioane de secvențe ADN, cu un „cod de bare” pentru a ține evidența modificărilor. Toate fără a rupe o singură catenă delicată de ADN.

Deocamdată, aceste instrumente biologice, numite „Retron Library Recombineering (RLR)” au fost testate doar în celule bacteriene. Dar ca CRISPRcălătoria lui către terapia genică arată, chiar și cele mai ciudate descoperiri de la creaturi umile pot catapulta cele mai sălbatice vise ale noastre de terapie genetică sau de biologie sintetică în realitate.

„Această lucrare ajută la stabilirea unei foi de parcurs către utilizarea RLR în alte sisteme genetice, ceea ce deschide multe posibilități interesante pentru cercetările genetice viitoare.” a spus Biserică.

Stai, de ce este CRISPR inadecvat?

Retronii sunt ciudați. În schimb, să începem cu CRISPR.

S-ar putea să fiți deja familiarizați cu modul în care funcționează. Există două componente: un tip de ARN și o proteină. ARN-ul de ghidare „houndhound” leagă proteina Cas „foarfecă” de o anumită genă. În versiunea clasică, Cas taie gena pentru a o opri. Progresele mai recente permit lui Cas să înlocuiască o anumită literă genetică sau să decupeze mai multe gene simultan.

Pentru versiunea de tăiere și înlocuire, pe măsură ce gena se vindecă singură, va căuta adesea un șablon. CRISPR poate purta o genă șablon pe care să se bazeze celula. În acest fel, celula este păcălită într-o copie genetică: înlocuirea unei propoziții genetice defecte cu una care este biologic gramaticală.

Problema cu CRISPR este tăierea ADN-ului. Dacă ați tăiat vreodată o propoziție pe telefon, v-ați dat seama că ați tăiat părțile greșite, ați lipit-o înapoi cu un alt mesaj care acum nu are sens și ați apăsat trimite - ei bine, asta este un fel de analog cu ceea ce se poate întâmpla cu CRISPR. Pericolul de deteriorare a genomului nostru crește atunci când trebuie să edităm mai multe gene. Aceasta devine o problemă masivă în biologia sintetică, care folosește manipularea genetică pentru a conferi celulelor noi abilități sau chiar pentru a crea organisme complet noi.

Celulele sunt creaturi încăpățânate dezvoltate din eoni de evoluție, așa că schimbarea unei singure gene este rareori suficientă pentru a obține, de exemplu, o bacterie pentru a pompa biocombustibili sau medicamente, ceea ce face necesară editarea genelor multiplexate. De asemenea, majoritatea celulelor se divid rapid, astfel încât este esențial ca orice modificare genetică să se mențină de-a lungul generațiilor. CRISPR se luptă adesea cu ambele. Echipa Bisericii crede că are o soluție.

Faceți cunoștință cu Retrons

Noul instrument se numește RLR, iar primul „R” înseamnă retroni. Acestea sunt creaturi larg răspândite, dar cu totul misterioase, a căror „biologie naturală... este în mare măsură necunoscută”, a scris echipa, deși similare cu CRISPR, ele pot fi implicate în sistemul imunitar al bacteriilor.

Descoperiți pentru prima dată în 1984, retronii sunt panglici plutitoare de ADN în unele celule bacteriene care pot fi convertite într-un anumit tip de ADN - un singur lanț de ADN numit ssDNAs (da, este ciudat). Dar aceasta este o veste fantastică pentru editarea genelor, deoarece ADN-ul celulelor noastre devine lanțuri simple impresionabile atunci când se divid. Momentul perfect pentru un switch-and-bait retron.

În mod normal, ADN-ul nostru există în elice duble care sunt strâns înfășurate în 23 de mănunchiuri, numite cromozomi. Fiecare fascicul de cromozomi vine în două copii, iar atunci când o celulă se divide, copiile se separă pentru a se duplica. În acest timp, cele două copii schimbă uneori gene într-un proces numit recombinare. Acesta este momentul în care retronii se pot strecura, introducând descendența lor ssADN în celulele care se divizează. Dacă poartă noi trucuri - să zicem, permițând unei celule bacteriene să devină rezistentă la medicamente - și să se introducă cu succes, atunci descendenții celulei vor moșteni acea trăsătură.

Datorită mecanismului natural al celulei, retronii se pot infiltra într-un genom fără a-l tăia. Și o pot face în milioane de celule în diviziune în același timp.

„Ne-am gândit că retronii ar trebui să ne ofere capacitatea de a produce ssADN în celulele pe care vrem să le editam, mai degrabă decât să încercăm să le forțăm în celulă din exterior și fără a deteriora ADN-ul nativ, care erau ambele calități foarte convingătoare”, a spus studiul. autor Dr. Daniel Goodman.

Crearea RTR

Similar cu CRISPR, RTR are mai multe componente: fragmentul de genă care conține o mutație (momeala) și două proteine, RT și SSAP (reverse transcriptase and single-stranded annealing proteins) care transformă retronul în ssDNA și îl lasă să se introducă singur. într-o celulă care se divide.

Încă cu mine?

La fel ca Game of Thrones, există o mulțime de jucători. Deci, ca să fie mai clar: retronii poartă codul genetic pe care vrem să-l inserăm; RT îl transformă într-o formă mai compatibilă numită ssDNA; și SSAP îl lipește în ADN pe măsură ce se împarte. Practic, un cal troian invadează celula și revarsă spioni care se introduc în celulă – schimbându-i ADN-ul – cu ajutorul unor magicieni enzimatici.

Cele două proteine ​​sunt noi pentru petrecere. Anterior, oamenii de știință au încercat să folosească retronii pentru editarea genelor, dar eficiența a fost extrem de scăzută - aproximativ 0.1% din toate celulele bacteriene infectate. Cei doi nou-veniți au liniștit „sistemul de alarmă” natural al bacteriilor care corectează modificările ADN-ului – așa că ignoră noile biți de ADN – și permit modificărilor să intre și să le transmită generației următoare. Un alt truc a fost să castrez două gene care codifică proteine ​​care în mod normal distrug ssDNA.

Într-un test, echipa a descoperit că peste 90% dintre celulele bacteriene au admis cu ușurință noua secvență retron în ADN-ul lor. Apoi au mers mari. În comparație cu CRISPR, retronii au un avantaj în sensul că secvența lor poate acționa ca un cod de bare. Aceasta înseamnă că este posibil să efectuați mai multe experimente de editare a genelor simultan și să vă dați seama ce celule au fost editate cu ce retron prin secvențierea codului de bare.

Într-un test de dovadă a conceptului, echipa a explodat unele celule bacteriene cu retroni care conțineau secvențe pentru rezistența la antibiotice. Prin secvențierea literelor ADN retron dintr-un grup de bacterii tratate cu antibiotice, ei au descoperit că celulele cu retroni - dându-le noua superputere împotriva medicamentelor - au rămas în porțiuni mult mai mari decât alte celule.

Într-un alt test, echipa a încercat să determine câți retroni ar putea folosi simultan. Au luat o altă tulpină de bacterii care este rezistentă la antibacteriene și i-au tăiat genomul pentru a construi o bibliotecă de zeci de milioane de retroni. Apoi au înfipt aceste bucăți în hula hoops de ADN - numite plasmide - și le-au plutit în celulele bacteriene. Ca și înainte, echipa a putut găsi cu ușurință retronii care confereau putere antibacteriană prin secvențierea codurilor de bare ale celor care au rămas în viață.

Dar de ce?

Așa e cum. Dar care este motivul?

Scopul este ușor: să găsești o altă soluție pentru CRISPR care să influențeze milioane de celule simultan, fără a deteriora celulele. Cu alte cuvinte, introduceți editarea genetică în era big data, prin mai multe generații.

În comparație cu CRISPR, noul instrument RLR este mai simplu, deoarece nu necesită un instrument de „ghid” în plus față de un instrument de „editare” – un retron este practic un instrument doi-în-unu. Capacitatea de a influența mai multe gene simultan - fără a le tăia fizic - îl face, de asemenea, un instrument intrigant pentru biologia sintetică. Instrumentul are și putere de rezistență. În loc de un etos CRISPR „un și gata”, acesta durează de-a lungul generațiilor pe măsură ce celulele se divid.

Acestea fiind spuse, RTR are concurență. Deoarece funcționează cel mai bine cu celulele în diviziune, s-ar putea să nu fie la fel de puternic în celulele reticente care refuză să se despartă, de exemplu, neuronii. Pe de altă parte, actualizările recente la CRISPR au făcut posibilă activarea sau dezactivarea genelor, fără a le tăia, prin epigenetică.

Dar RLR oferă scară. „Abilitatea de a analiza biblioteci de mutanți cu coduri de bare combinate cu RLR permite realizarea a milioane de experimente simultan, permițându-ne să observăm efectele mutațiilor în genom, precum și modul în care aceste mutații ar putea interacționa între ele”, a spus Church.

Credit imagine: Pete Linforth din Pixabay

Sursa: https://singularityhub.com/2021/05/11/a-new-gene-editing-tool-rivals-crispr-and-can-make-millions-of-edits-at-once/