Новый инструмент редактирования генов конкурирует с CRISPR и может вносить миллионы изменений одновременно

С стремительным ростом CRISPR как чудо редактирования генов легко забыть о его скромном происхождении: он был впервые обнаружен как причуда бактериальной иммунной системы.

Кажется, бактерии могут предложить больше. В этом месяце команда под руководством знаменитого биолога-синтетика доктора. Георгиевская церковь в Гарвардском университете похитили еще один странный образец биологии бактерий. В результате это мощный инструмент, который теоретически может одновременно редактировать миллионы последовательностей ДНК с помощью «штрих-кода» для отслеживания изменений. И все это без разрыва ни единой хрупкой нити ДНК.

На данный момент эти биологические инструменты, называемые «рекомбинирование ретронной библиотеки (RLR)», были протестированы только на бактериальных клетках. Но CRISPRпутешествие в генной терапии показывает, что даже самые странные открытия, сделанные низшими существами, могут катапультировать наши самые смелые мечты о генной терапии или синтетической биологии в реальность.

«Эта работа помогает составить дорожную карту к использованию RLR в других генетических системах, которая открывает много захватывающих возможностей для будущих генетических исследований», — сказал Церковь.

Подождите, почему CRISPR неадекватен?

Ретроны странные. Вместо этого начнем с CRISPR.

Возможно, вы уже знакомы с тем, как это работает. Есть два компонента: тип РНК и белок. Направляющая РНК «ищейки» связывает «ножничный» белок Cas с определенным геном. В классической версии Кас рубит ген, чтобы выключить его. Более поздние достижения позволяют Cas заменить конкретную генетическую букву или отрезать сразу несколько генов.

В случае с вариантом «рубить и заменять», когда ген исцеляет сам себя, он часто будет искать шаблон. CRISPR может нести матричный ген, на который может полагаться клетка. Таким образом клетку вводят в модификацию генетической копии: заменяя дефектное генетическое предложение на биологически грамматическое.

Проблема с CRISPR - это разрезание ДНК. Если вы когда-либо сокращали предложение на своем телефоне, понимали, что вы вырезали неправильные фрагменты, вставляли его обратно с другим сообщением, которое теперь не имеет смысла, и нажимали «Отправить» - ну, это вроде аналогично тому, что может случиться с CRISPR. Опасность повреждения нашего генома возрастает, когда нам нужно редактировать несколько генов. Это становится огромной проблемой в синтетической биологии, которая использует генетические манипуляции для наделения клеток новыми способностями или даже для создания совершенно новых организмов.

Клетки - упрямые существа, появившиеся в течение эонов эволюции, поэтому изменения одного гена редко бывает достаточно, чтобы заставить, например, бактерии выкачивать биотопливо или лекарства, что делает необходимым редактирование мультиплексных генов. Большинство клеток также быстро делятся, поэтому для любых генетических изменений важно, чтобы они передавались из поколения в поколение. CRISPR часто борется с обоими. Команда Церкви думает, что у них есть решение.

Познакомьтесь с ретронами

Новый инструмент называется RLR, а первая буква «R» означает ретроны. Это широко распространенные, но совершенно загадочные существа, чья «естественная биология… в значительной степени неизвестна», пишет команда, хотя, подобно CRISPR, они могут быть вовлечены в иммунную систему бактерий.

Ретроны, впервые обнаруженные в 1984 году, представляют собой плавающие ленты ДНК в клетках некоторых бактерий, которые могут быть преобразованы в ДНК определенного типа — одну цепочку ДНК, получившую название оцДНК (да, это странно). Но это фантастическая новость для редактирования генов, потому что ДНК наших клеток при делении становится восприимчивыми одиночными цепочками. Идеальное время для ретронской подмены и приманки.

Обычно наша ДНК существует в виде двойных спиралей, которые плотно свернуты в 23 пучка, называемых хромосомами. Каждый пучок хромосом состоит из двух копий, и когда клетка делится, копии разделяются, дублируя себя. В это время две копии иногда обмениваются генами в процессе, называемом рекомбинацией. Именно в этот момент ретроны могут проникнуть внутрь, вместо этого внедряя свое потомство оцДНК в делящиеся клетки. Если они применят новые трюки — скажем, позволят бактериальной клетке стать устойчивой к лекарствам — и успешно внедрятся, то потомство клетки унаследует эту особенность.

Благодаря естественному механизму клетки ретроны могут проникать в геном, не разрезая его. И они могут делать это в миллионах делящихся клеток одновременно.

«Мы решили, что ретроны должны дать нам возможность производить оцДНК в клетках, которые мы хотим редактировать, а не пытаться заставить их проникнуть в клетку извне, и без повреждения нативной ДНК, что было очень убедительно», - говорится в исследовании. автор доктор Дэниел Гудман.

Создание РТР

Подобно CRISPR, RTR состоит из нескольких компонентов: фрагмент гена, который содержит мутацию (приманка), и два белка, RT и SSAP (обратная транскриптаза и одноцепочечные белки отжига), которые преобразуют ретрон в оцДНК и позволяют ему встроиться. в делящуюся клетку.

Все еще со мной?

Как и в «Игре престолов», здесь много игроков. Итак, чтобы было понятнее: ретроны несут генетический код, который мы хотим вставить; RT превращает его в более совместимую форму, которая называется оцДНК; а SSAP вставляет его в ДНК по мере ее деления. По сути, троянский конь вторгается в клетку и извергает шпионов, которые внедряются в клетку, изменяя ее ДНК, с помощью ферментативных магов.

Эти два белка являются новыми для вечеринки. Ранее ученые пытались использовать ретроны для редактирования генов, но эффективность была крайне низкой — около 0.1 процента всех зараженных бактериальных клеток. Два новичка успокоили естественную «систему сигнализации» бактерий, которая корректирует изменения ДНК (поэтому они игнорируют новые биты ДНК) и позволяют изменениям проникнуть и передаться следующему поколению. Еще один трюк заключался в кастрации двух генов, кодирующих белки, которые обычно разрушают оцДНК.

В одном тесте команда обнаружила, что более 90 процентов бактериальных клеток легко допускают новую последовательность ретрона в свою ДНК. Затем они стали большими. По сравнению с CRISPR, ретроны имеют преимущество в том, что их последовательность может действовать как штрих-код. Это означает, что можно проводить несколько экспериментов по редактированию генов одновременно и выяснять, какие клетки редактировались с помощью какого ретрона, путем секвенирования штрих-кода.

В ходе проверки концепции команда взорвала некоторые бактериальные клетки ретронами, которые содержали последовательности для определения устойчивости к антибиотикам. Посредством секвенирования только ретронных букв ДНК из пула бактерий, обработанных антибиотиками, они обнаружили, что клетки с ретронами, дающие им новую суперсилу против лекарств, остались в гораздо большем количестве, чем другие клетки.

В другом тесте команда попыталась определить, сколько ретронов они смогут использовать одновременно. Они взяли другой штамм бактерий, устойчивый к антибактериальным препаратам, и измельчили его геном, чтобы создать библиотеку из десятков миллионов ретронов. Затем они вставили эти кусочки в обручи ДНК, называемые плазмидами, и поместили их в бактериальные клетки. Как и раньше, команда могла легко найти ретроны, обладающие антибактериальной силой, путем секвенирования штрих-кодов тех, кто остался в живых.

Но почему?

Вот как. Но почему?

Цель проста: найти другое решение для CRISPR, которое могло бы влиять на миллионы клеток одновременно, не повреждая клетки. Другими словами, перенесите редактирование генов в эпоху больших данных через несколько поколений.

По сравнению с CRISPR, новый инструмент RLR проще, потому что он не требует «направляющего» инструмента в дополнение к «редактирующему» инструменту - ретрон, по сути, представляет собой устройство «два в одном». Возможность влиять на несколько генов одновременно - не врезаясь в них физически - также делает его интригующим инструментом для синтетической биологии. Инструмент также обладает выносливостью. Вместо идеала CRISPR «все готово» он действует на протяжении поколений по мере деления клеток.

Тем не менее, у РТР есть конкуренты. Поскольку он лучше всего работает с делящимися клетками, он может быть не таким эффективным в сопротивляющихся клетках, которые отказываются делиться, например, в нейронах. С другой стороны, недавние обновления CRISPR позволили также включать и выключать гены, не разрезая их, посредством эпигенетики.

Но RLR предлагает масштаб. «Возможность анализировать объединенные библиотеки мутантов со штрих-кодами с помощью RLR позволяет проводить миллионы экспериментов одновременно, что позволяет нам наблюдать эффекты мутаций в геноме, а также то, как эти мутации могут взаимодействовать друг с другом», - сказал Черч.

Изображение Фото: Пит Линфорт от Pixabay

Источник: https://singularityhub.com/2021/05/11/a-new-gene-editing-tool-rivals-crispr-and-can-make-millions-of-edits-at-once/