Ett nytt genredigeringsverktyg konkurrerar med CRISPR och kan göra miljontals redigeringar på en gång

Med CRISPRs snabba uppgång som ett genredigeringsunderverk är det lätt att glömma dess låga ursprung: det upptäcktes först som en egenhet i det bakteriella immunsystemet.

Det verkar som att bakterier har mer att erbjuda. Denna månad ledde ett team av den berömda syntetiska biologen Dr. George Church vid Harvard University kapade ett annat konstigt stycke bakteriebiologi. Resultatet är ett kraftfullt verktyg som – i teorin – samtidigt kan redigera miljontals DNA-sekvenser, med en "streckkod" för att hålla reda på förändringar. Allt utan att bryta en enda känslig DNA-sträng.

För närvarande har dessa biologiska verktyg, kallade "Retron Library Recombineering (RLR)," endast testats i bakterieceller. Men som Crisprresan till genterapi visar att även de konstigaste upptäckterna från låga varelser kan förverkliga våra vildaste genterapi- eller syntetiska biologidrömmar.

"Detta arbete hjälper till att skapa en vägkarta för att använda RLR i andra genetiska system, vilket öppnar upp för många spännande möjligheter för framtida genetisk forskning," sade Kyrka.

Vänta, varför är CRISPR otillräckligt?

Retroner är konstiga. Låt oss börja med CRISPR istället.

Du kanske redan är bekant med hur det fungerar. Det finns två komponenter: en typ av RNA och ett protein. "Bloodhound"-guide-RNA:t binder Cas-"sax"-proteinet till en viss gen. I den klassiska versionen hackar Cas upp genen för att stänga av den. Nyare framsteg tillåter Cas att ersätta en specifik genetisk bokstav, eller klippa flera gener samtidigt.

För hacka-och-ersätt-versionen, när genen läker sig själv, kommer den ofta att söka efter en mall. CRISPR kan bära en mallgen som cellen kan lita på. På så sätt luras cellen in i en genetisk kopia: att ersätta en defekt genetisk mening med en som är biologiskt grammatisk.

Problemet med CRISPR är hackningen av DNA. Om du någonsin har klippt en mening på din telefon, insett att du klippt ut fel bitar, klistrat tillbaka den med ett annat meddelande som nu inte är vettigt och tryckt på skicka—ja, det är ungefär analogt med vad som kan hända med CRISPR. Risken för skador på vårt arvsmassa ökar när vi behöver redigera flera gener. Detta blir ett enormt problem inom syntetisk biologi, som använder genetisk manipulation för att ge celler nya förmågor, eller till och med konstruera helt nya organismer.

Celler är envisa varelser som utvecklats från eoner av evolution, så att ändra en enskild gen är sällan tillräckligt för att få till exempel en bakterie att pumpa ut biobränslen eller mediciner, vilket gör multiplexerad genredigering nödvändig. De flesta celler delar sig också snabbt, så att det är viktigt för alla genetiska mixtrande att hålla fast i generationer. CRISPR kämpar ofta med båda. Kyrkans team tror att de har en lösning.

Möt Retrons

Det nya verktyget heter RLR, och det första "R" står för retroner. Dessa är utbredda men helt mystiska varelser vars "naturliga biologi ... är till stor del okänd", skrev teamet, även om de liknar CRISPR, kan de vara involverade i bakteriens immunsystem.

Upptäcktes först 1984, retroner är flytande band av DNA i vissa bakterieceller som kan omvandlas till en specifik typ av DNA - en enda kedja av DNA som kallas ssDNA (japp, det är konstigt). Men det är fantastiska nyheter för genredigering, eftersom våra cellers DNA blir lättpåverkade enkla kedjor när de delar sig. Perfekt timing för en retron switch-and-bete.

Normalt finns vårt DNA i dubbla helixar som är tätt inlindade i 23 buntar, så kallade kromosomer. Varje kromosombunt kommer i två exemplar, och när en cell delar sig separeras kopiorna för att duplicera sig själva. Under denna tid byter de två kopiorna ibland gener i en process som kallas rekombination. Det är då retroner kan smyga sig in och istället infoga sin ssDNA-avkomma i de delande cellerna. Om de bär på nya knep - säg att låta en bakteriecell bli resistent mot droger - och framgångsrikt sätter in sig själva, då kommer cellens avkomma att ärva den egenskapen.

På grund av cellens naturliga maskineri kan retroner infiltrera ett genom utan att skära det. Och de kan göra det i miljontals delande celler samtidigt.

"Vi tänkte att retroner borde ge oss möjligheten att producera ssDNA i cellerna vi vill redigera snarare än att försöka tvinga in dem i cellen från utsidan, och utan att skada det inhemska DNA, som båda var mycket övertygande egenskaper," sade studien författaren Dr Daniel Goodman.

Tillverkningen av RTR

I likhet med CRISPR har RTR flera komponenter: fragmentet av genen som innehåller en mutation (betet) och två proteiner, RT och SSAP (omvänt transkriptas och enkelsträngade hybridiseringsproteiner) som omvandlar retronen till ssDNA och låter den infoga sig själv in i en delande cell.

Fortfarande med mig?

Precis som Game of Thrones finns det många spelare. Så för att göra det tydligare: retroner bär den genetiska koden vi vill infoga; RT gör det till en mer kompatibel form som kallas ssDNA; och SSAP sticker in det i DNA när det delar sig. I grund och botten invaderar en trojansk häst cellen och häller ut spioner som sätter sig in i cellen – ändrar dess DNA – med hjälp av enzymatiska magiker.

De två proteinerna är nya för partiet. Tidigare har forskare försökt använda retroner för genredigering, men effektiviteten var extremt låg - runt 0.1 procent av alla infekterade bakterieceller. De två nykomlingarna tystade ner bakteriens naturliga "larmsystem" som korrigerar DNA-förändringar - så de ignorerar de nya DNA-bitarna - och låter redigeringar komma in och skickas vidare till nästa generation. Ett annat knep var att kastrera två gener som kodar för proteiner som normalt förstör ssDNA.

I ett test fann teamet att över 90 procent av bakteriecellerna lätt släppte in den nya retronsekvensen i sitt DNA. Därefter blev de stora. Jämfört med CRISPR har retroner ett ben upp genom att deras sekvens kan fungera som en streckkod. Detta innebär att det är möjligt att utföra flera genredigeringsexperiment samtidigt och ta reda på vilka celler som redigerades med vilken retron genom att sekvensera streckkoden.

I ett proof-of-concept-test sprängde teamet några bakterieceller med retroner som innehöll sekvenser för antibiotikaresistens. Genom att enbart sekvensera retron-DNA-bokstäverna från en pool av bakterier behandlade med antibiotika fann de att celler med retroner – vilket ger dem den nya superkraften mot droger – fanns kvar i mycket högre portioner än andra celler.

I ett annat test försökte teamet avgöra hur många retroner de kunde använda samtidigt. De tog en annan bakteriestam som är resistent mot antibakteriella ämnen och skar upp dess genom för att bygga ett bibliotek med tiotals miljoner retroner. De stack sedan in dessa bitar i hulahopringar av DNA – kallade plasmider – och flöt dem in i bakterieceller. Som tidigare kunde teamet enkelt hitta de retroner som gav antibakteriell kraft genom att sekvensera streckkoderna för de som förblev vid liv.

Men varför?

Det är så. Men vad är varför?

Målet är enkelt: att hitta en annan lösning på CRISPR som kan påverka miljontals celler samtidigt, utan att skada cellerna. Med andra ord, ta genredigering in i big data-eran, genom flera generationer.

Jämfört med CRISPR är det nya RLR-verktyget enklare eftersom det inte kräver ett "guide"-verktyg förutom ett "redigerings"-verktyg - en retron är i grunden en två-i-ett. Att kunna påverka flera gener samtidigt - utan att fysiskt skära i dem - gör det också till ett spännande verktyg för syntetisk biologi. Verktyget har också uthållighet. Istället för ett "ett och gjort" CRISPR-etos varar det genom generationer när celler delar sig.

Som sagt, RTR har konkurrens. Eftersom det fungerar bäst med delande celler, kanske det inte är lika kraftfullt i motvilliga celler som vägrar att dela sig - till exempel neuroner. För en annan har de senaste uppgraderingarna av CRISPR gjort det möjligt att även slå på eller av gener – utan att skära av dem – genom epigenetik.

Men RLR erbjuder skala. "Att kunna analysera poolade, streckkodade mutantbibliotek med RLR gör att miljontals experiment kan utföras samtidigt, vilket gör att vi kan observera effekterna av mutationer över genomet, såväl som hur dessa mutationer kan interagera med varandra," sa Church.

Image Credit: Pete Linforth från Pixabay

Källa: https://singularityhub.com/2021/05/11/a-new-gene-editing-tool-rivals-crispr-and-can-make-millions-of-edits-at-once/