Design De Novo a filamentelor de proteine elicoidale cu auto-asamblare sensibile la PH

Republicat de Platon

Urmaritori: 0

Strategia de proiectare computațională

Bucle scurte pentru conectarea elicelor pRO-2.3 într-un singur lanț au fost proiectate folosind o bază de date exhaustivă de mostre de coloană vertebrală compusă din fragmente care se întind pe două regiuni elicoidale, așa cum sunt identificate de DSSP în structuri cristalografice de înaltă rezoluție (așa cum s-a descris anterior¹⁴). Buclele au fost identificate în această bază de date prin alinierea rigidă a reziduurilor terminale ale fragmentului și țintei folosind un algoritm de suprapunere optimizat¹⁵. Candidații care au îndeplinit o toleranță de aliniere de 0.35 Å RMSD au fost aliniați la coloana vertebrală țintă prin coordonate de torsiune-spațiu și constrângeri de coordonate soft la coordonatele de atomi grei ale coloanei vertebrale candidate aliniate. Secvențele de bucle candidate au fost apoi proiectate sub constrângerile profilului de secvență generate prin alinierea coloanei vertebrale a buclei la baza de date a structurii sursă. Candidații cu cele mai mici scoruri au fost selectați pentru proiectarea finală a buclei.

Andocare elicoidal și metode de proiectare⁷ au fost aplicate la pRO-2.3 conectat pentru a genera modele de design de filament elicoidal. Următoarele criterii au filtrat traiectorii de proiectare individuale: o discrepanță care depășește −15.0 unități de energie Rosetta între stările legate (polimerice) și nelegate (monomerice), o suprafață de interfață care depășește 700 Å², o complementaritate de formă Rosetta care depășește 0.62 și un număr de reziduuri polare nesatisfăcute sub 5. Modelele care îndeplinesc aceste criterii au suferit o rafinare manuală, implicând reversiuni într-un singur punct la mutații considerate necontributive la stabilizarea stării de legătură a interfeței. Designul cu scoruri superioare pentru fiecare configurație de andocare a fost apoi integrat într-un set de proteine finalizat pentru validarea experimentală.

Exprimarea și purificarea proteinelor

Genele sintetice pentru un total de 18 modele au fost optimizate pentru exprimare în Escherichia coli și dobândit de la IDT, apoi inserat în situsul de donare multiplu al vectorului pET29b+ între situsurile de restricție Ndel și Xhol. Aceste construcții au fost introduse în BL21* (DE3) E. coli celule competente. Transformanții au fost cultivați în 50 ml mediu Terrific Broth suplimentat cu 200 mg l^-1 kanamicina. Exprimarea, sub controlul unui promotor T7, a continuat timp de 24 de ore la 37 °C folosind autoinducția Studier¹⁶ până când culturile au fost recoltate prin centrifugare. Peletele celulare au fost resuspendate în soluție salină tamponată cu Tris (TBS) și lizate cu detergent Bugbuster. Fracția solubilă, clarificată prin centrifugare, a suferit purificare prin Ni²⁺ cromatografia de afinitate cu metal imobilizat folosind rășină Ni-NTA Superflow. Rășina cu lizat de celule legate a fost spălată cu zece volume de coloană de 40 mM imidazol și 500 mM NaCI, urmată de eluare cu 400 mM imidazol și 75 mM NaCI. Fracțiile solubile și insolubile au fost supuse analizei electroforezei pe gel SDS-poliacrilamidă. Probele care prezintă benzi de proteine la greutatea moleculară corectă au fost alese pentru screening-ul cu microscopie electronică. Modelele selectate au fost mărite la 0.5 l pentru o caracterizare ulterioară, expresia continuând din nou timp de 24 de ore la 37 ° C folosind autoinducția Studier¹⁶ înainte de recoltare prin centrifugare. Peletele celulare au fost resuspendate în TBS și lizate prin microfluidizare, urmată de purificare așa cum este descris mai sus.

Pată negativă EM

Fracțiile solubile au fost concentrate în TBS (25 mM tampon Tris, 75 mM NaCI, pH 8) pentru screening-ul prin microscopie electronică. O picătură de 6 µl (probă de 1 µl diluată instantaneu cu 5 µl de tampon) a fost aplicată pe grile de cupru de 200 de mesh, acoperite cu carbon, descărcate negativ, spălate cu apă Milli-Q și colorate folosind fie formiat de uranil 0.75% (pH 4.0). ) sau Nano-W (pH 6.8) achiziționate de la Nanoprobes, Inc. așa cum s-a descris anterior¹⁷. Screening-ul a fost efectuat folosind fie un microscop electronic cu transmisie Morgagni M100 de 268 kV (FEI), fie un microscop electronic cu transmisie Talos L120C de 120 kV (ThermoFisher). Imaginile au fost capturate folosind un sistem de cameră Teitz CMOS 4k cu montare inferioară și procesate pentru un contrast îmbunătățit folosind software-ul Fiji (versiunea: 2.14.0/1.54f)¹⁸ pentru claritate.

Lungimile fibrelor au fost cuantificate folosind algoritmul de urmărire a fibrelor în cryoSPARC⁸. Această metodă identifică fibrele prin corelarea încrucișată cu o clasă șablon și urmărirea fibrelor adiacente din particulele identificate. O clasă șablon generată din DpHF19 a fost utilizată pentru toate fibrele măsurate. Fibrele au fost filtrate în funcție de curbura medie (<0.0005 Å^-1) și media corelației încrucișate normalizate (>0.5) pentru fiecare fibră. Pentru DpHF18, am folosit 5, 2, 3, 20, 28 și 21 de imagini pentru pH 3, 3.5, 4.2, 5, 8 și, respectiv, 3 până la 8. Pentru DpHF19, am folosit 7, 8, 8, 28, 4 și 5 imagini pentru pH 3, 3.5, 4.2, 5, 8 și, respectiv, 3 până la 8. Pentru DpHF19_9his, am folosit 6, 6, 8, 14, 15, 8 și 4 imagini au fost utilizate pentru pH 3, 3.5, 4.2, 5, 6, 8 și, respectiv, 3 până la 8.

Crio-EM

Probele Cryo-EM au fost preparate prin aplicarea proteinei pe grilele de carbon cu gauri CFLAT, ștergerea lichidului și scufundarea grilelor în etan lichid folosind un Vitrobot (ThermoFisher). Pentru DpHF19, videoclipurile au fost achiziționate pe un microscop Glacios (ThermoFisher) echipat cu o cameră K-2 Summit Direct Detect (Gatan Inc.) care funcționează în modul de numărare, cu o dimensiune a pixelului de 1.16 Å per pixel, 50 de cadre și o doză totală de electroni de 65 Å^-². Pentru DpHF18 și DpHF7, videoclipurile au fost achiziționate pe un Titan Krios (ThermoFisher) echipat cu o cameră K-2 Summit Direct Detect (Gatan Inc.) care funcționează în modul super-rezoluție, cu o dimensiune a pixelului de 0.525 Å per pixel, 50 de cadre și o doză totală de electroni de 90 Å^-². Colectarea automată a datelor a fost efectuată folosind Leginon¹⁹ versiunea 3.4. Prelucrarea datelor a fost efectuată folosind cryoSPARC⁸, iar fluxurile de lucru sunt rezumate în figurile suplimentare. 10-12. Videoclipurile au fost aliniate prin corecția mișcării patch-urilor, cu videoclipuri de super-rezoluție stocate la o dimensiune a pixelilor de 1.05 Å. Parametrii funcției de transfer de contrast (CTF) au fost estimați folosind patch-ul CTF. Trasarea filamentului fără șablon a fost efectuată pe un subset de imagini, iar particulele rezultate au fost supuse clasificării 2D. Clasele 2D selectate au fost apoi folosite ca șabloane pentru urmărirea filamentului bazată pe șabloane pe seturi de date complete. După mai multe runde de clasificare 2D, particulele selectate au fost supuse rafinării 3D cu simetria elicoială impusă și rafinarea neuniformă activată. Pentru DpHF19, am impus simetria elicoială cu un început care raportează subunități individuale, fără contact, mai degrabă decât parametrii de simetrie elicoială cu două porniri. Pentru DpHF7 și DpHF19, defocalizarea per-particulă, înclinarea fasciculului și aberația sferică au fost de asemenea rafinate. Modificarea densității a fost efectuată folosind ResolveCryoEM în Phenix^20,21 versiunea phenix-1.20.1. Modelele atomice pentru DpHF18 și DpHF19 au fost rafinate în hărți crio-EM folosind ISOLDE²², urmată de rafinarea spațiului real în Phenix, cu restricțiile rotamer și Ramachandran dezactivate și cu restricții de referință impuse de modelul de pornire de intrare. Elucidarea modelului pentru DpHF7 a folosit protocolul de construire a modelului de novo pe densitatea unității asimetrice cryo-EM segmentate²³. Încorporarea și rafinarea ulterioară a reziduurilor au fost realizate folosind RosettaCM²⁴ versiunea 2019.31, valorificând simetria pe harta crio-EM nesegmentată pentru o potrivire optimă la densitate și interfețe intra-filament. O rundă finală de rafinare în spațiu real a fost efectuată în Phenix, așa cum este descris mai sus pentru DpHF18 și DpHF19. Statisticile de colectare, rafinare și validare a datelor Cryo-EM sunt rezumate în tabelul suplimentar 1.

TIRFM

Ansamblu de fibre

Pentru imaginea nucleării însămânțate a fibrelor sensibile la pH, fibrele DpHF18 au fost etichetate cu doi fluorofori diferiți conjugați cu maleimidă, Oregon488 și sulfo-Cy5. Fibrele au fost marcate cu un exces molar de 10x, în PBS + 1 mM TCEP timp de 4 ore la temperatura camerei, înainte de schimbarea tamponului în TBS (25 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0) pe o coloană de spin Zeba și concentrarea la 30 μM . Fibrele verzi la 30 μM au fost dezasamblate prin adăugarea de 1 M citrat (0.6 μl de citrat la 20 μl de fibre) pentru a reduce pH-ul la 3.0. Soluția a fost incubată timp de 5 minute înainte de adăugarea de Tris (3.6 μl de stoc 1 M) pentru a aduce pH-ul înapoi la 8.0; La soluție s-a adăugat 1 μl de fibre DpHF18-Cy5 asamblate la 30 μM. Soluția a fost ulterior incubată la temperatura camerei înainte de centrifugare la 13,000 g timp de 2 minute într-o centrifugă de masă. Fibrele au fost resuspendate în TBS și au fost fotografiate de TIRFM.

Dezasamblarea fibrelor

Imagistica TIRFM rapidă a fibrelor dezasamblate la pH scăzut a fost realizată pe un sistem TIRF personalizat bazat pe un suport Nikon Ti echipat cu un sistem de focalizare perfectă alături de un sistem rapid Z etapă piezo (ASI), un iluminator TIRF azimutal (iLas2, Roper France) cu un câmp vizual extins personalizat (Cairn) și un obiectiv PLAN Apo 1.45 NA ×100. Imaginile au fost achiziționate cu o cameră sCMOS retroiluminată Photometrics Prime 95B, rulată în modul pseudo obturator global, sincronizat cu iluminarea azimutală. Sistemul a fost operat de Metamorph 7.10.1.161. Fibrele marcate cu maleimidă Sulfo-Cy5 au fost fotografiate cu un laser de 630 nm (150 mW Coherent OBIS montat într-o lansare laser Cairn) și fotografiate folosind un filtru Chroma ET655lp montat într-o roată Cairn Optospin la o rată de cadru de 1 cadru la fiecare 16 ms.

Fibrele au fost fotografiate într-un tampon de imagistică (25 mM Tris pH 8.0, 100 mM NaCl) într-o celulă de flux Ibidi montată pe lamele de acoperire pentru cameră curată (personalizate, 25 × 75 mm², Nexterion) și pasivizat cu PLL-PEG (0.1 mg ml^-1 în 20 mM Hepes, pH 7.6; 5 minute). Fibrele au fost lăsate să se depună pe lamela timp de 5 minute înainte ca fibrele nelegate să fie îndepărtate cu tamponul de imagistică. În timpul achiziției rapide, pH-ul a fost redus prin curgerea în tampon cu pH scăzut (25 mM Tris, 100 mM NaCI, pH 3.0).

Pentru a măsura dezasamblarea fibrelor în soluție în vrac, fibrele preformate în tuburi Eppendorf de 1.5 ml au fost schimbate în tampon citrat la pH mai scăzut pentru a stimula dezasamblarea. O porțiune din fiecare reacție cu pH a fost îndepărtată la diferite momente și adăugată pe o placă cu 96 de godeuri și timp de 10 minute pentru a permite fibrelor să se aseze și să adere la substratul de sticlă. Pentru fiecare condiție și punct de timp, nouă câmpuri vizuale au fost obținute pe un microscop IN Cell Analyzer 2500HS (dispozitive moleculare) folosind un obiectiv de aer Nikon ×60 PLAN Apo 0.95 NA și o sursă de excitație LED de 631 nm, timp de expunere de 150 ms cu emisia colectată printr-un filtru trece-bandă de 684 ± 24 nm. Imaginile au fost cuantificate folosind un script personalizat CellProfiler pentru a segmenta fibrele cu algoritmul de prag Otsu²⁵. Limitele superioare și inferioare ale pragului, precum și fereastra adaptivă pentru ID-ul obiectului, au fost ajustate până când fibrele au fost identificate corect în raport cu semnalul de fundal. Lungimea axei majore a obiectelor identificate folosind conducta CellProfiler a fost reprezentată în funcție de timpul de incubare pentru fiecare condiție de pH.

AFM în fază lichidă

pregătirea unei mostre

Am incubat 10 ui dintr-o soluție de poli-lizină 0.01% în greutate pe o suprafață de mică muscovit proaspăt scindată (12 mm, Ted Pella Inc.) timp de 2 minute. Excesul de soluție a fost îndepărtat și suprafața a fost clătită cu apă și uscată cu N₂ gaz⁷. Apoi 30 ui soluție de proteină 10 uM în tamponul de imagistică (25 mM Tris-HCI, 400 mM NaCI la pH 8) au fost incubate pe mica acoperită cu polilizină timp de 30 de minute și spălate cu tamponul de imagine pentru a îndepărta excesul de proteină. pH-ul tamponului de dezasamblare (25 mM Tris-HCl, 400 mM NaCI, pH 4.1, 4.4, 4, 5 sau 4.7) a fost ajustat cu NaOH 10 M sau acid citric 1 M și filtrat cu un filtru PVDF cu dimensiunea porilor de 0.1 µm înainte de utilizare. . Pentru experimente cu fotoacizi, soluție de proteină 10 uM în Tris-HCI 25 mM pH 8 a fost incubată pe mica goală timp de 30 de minute și spălată cu Tris-HCI 25 mM pH 5.5; a fost efectuată o etapă suplimentară de depunere și clătire dacă densitatea numărului de fibre de pe suprafață a fost scăzută. De asemenea, am preparat proaspăt 1 mM 2-nitrobenzaldehidă (Sigma-Aldrich) în 25 mM Tris-HCl pH 5.5 și am folosit-o imediat fără expunere la lumină în orice stadiu²⁶. Măsurătorile spectroscopice și ale pH-ului au indicat că 2-nitrobenzaldehida este activabilă între lungimi de undă de 200 și 405 nm și scade pH-ul de la 5.5 la 2.7 și că o intensitate mai mare a laserului duce la un consum mai rapid și la acidificare.

Imaging

Pentru studiul cinetic la compoziție constantă, substraturile de mică poli-lizină acoperite cu proteine au fost plasate sub celula lichidă AFM (Bruker Multimode8). Imaginile au fost capturate în tamponul de imagistică utilizând o consolă curată cu nitrură de siliciu (Bruker, SNL-10, constantă a arcului: 0.12 Nm^-1, UV ozonat timp de 5 minute) în modul de atingere la temperatura camerei (25 °C). Înainte de curgerea tamponului de dezasamblare, fibrele au fost fotografiate în mod continuu timp de 10 minute pentru a optimiza parametrii (256 de linii de scanare, rată de scanare de 1.5 Hz, câștig integral ridicat (3–4) și amplitudine liberă de 50–100 mV). După ce s-a confirmat că nu a avut loc nicio deteriorare indusă de cantilever, tamponul de dezasamblare a fost injectat continuu la 25 µl min.^-1. Configurarea fluxului direct a fost optimizată pentru a oferi un timp de rezidență neglijabil și o schimbare rapidă a pH-ului¹⁰.

Pentru studiul fotoacid, mica acoperită cu proteine cu 25 mM Tris-HCl pH 5.5 a fost plasată sub celula lichidă a unui Cypher VRS AFM (Asylum Research) echipat cu laser BlueDrive (filtru de intensitate × 0.3, lungime de undă 405 nm) cu supapă de aerisire. deschis și operat în modul de atingere. După confirmarea acoperirii suprafeței mari a fibrelor, tamponul de imagistică a fost înlocuit cu 1 mM 2-nitrobenzaldehidă în 25 mM Tris-HCl pH 5.5, a fost operat fără expunere la lumina vizibilă de fundal și a fost fotografiat din nou. Consolul a fost apoi retras și BlueDrive a fost pornit și rasterizat în zonele preselectate în mod repetat, folosind microscopul optic motorizat al AFM. Timpul total de expunere la UV în timpul rasterului/stăpânirii pentru modelele de puncte și linii nu a fost mai mare de 10 minute, după care cantileverul a fost mutat înapoi în zonele expuse și a fost fotografiat. Pentru modificări globale ale pH-ului, fereastra de cuarț a celulei lichide AFM în contact cu soluția de fotoacid a fost expusă la o lampă UV portabilă (lungime de undă de 364 nm) timp de 7 minute și apoi a fost fotografiată.

Imaginile au fost procesate cu software-ul de analiză a datelor Gwyddion SPM v2.62 și analizate cu software-ul Fiji v1.53s¹⁸. Pentru cinetică, lungimea totală a fibrei a fost măsurată și orice fragmente considerate ca fiind deja dezasamblate au fost excluse de la măsurarea lungimii. Pentru a măsura viteza de dezasamblare la fiecare capăt al fibrelor individuale (Fig. 8), centrul fibrei (jumătate din lungimea inițială) a fost atribuit ca al doilea capăt pentru măsurarea lungimii, în timp ce pentru fragmentele de fibre, centrul fragmentului a fost măsurat ca al doilea capăt.